摘? 要：目的? 基于指紋圖譜和網絡藥理學分析預測當歸四逆湯(DSD)中桂枝的質量標志物(Q-marker)。方法?建立桂枝水煎液和DSD的指紋圖譜，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012年版)進行分析；采用網絡藥理學篩選和分析桂枝相關成分的作用靶點和通路，構建“成分-靶點-通路”網絡，預測DSD中桂枝潛在的Q-marker。結果?建立了15批桂枝水煎液和15批DSD的指紋圖譜，相似度均＞0.96，并指認出7個共有成分，分別為原兒茶酸、香豆素、肉桂酸、桂皮醛、桂皮醇、2-甲氧基肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛；通過網絡藥理學篩選出桂枝的5個活性成分、7個核心靶點和15條關鍵通路；基于Q-marker“五原則”分析預測2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛、肉桂酸為其潛在的Q-marker。結論?通過指紋圖譜和網絡藥理學分析預測DSD中桂枝的Q-marker，為全面控制DSD的質量提供依據，為進一步研究DSD的作用機制提供參考，同時為經典名方中復方及單味藥的Q-marker的關聯性研究提供示范。

當歸四逆湯(DSD)是張仲景《傷寒論》中的經典名方之一。《傷寒論》第351條言：“手足厥寒，脈細欲絕者，當歸四逆湯主之。”DSD由當歸、桂枝、白芍、細辛、甘草、木通、大棗7味藥組成，具有溫運血行、散寒通脈等功效，主治血虛寒厥證^[1-2]。現代臨床在內科、外科、婦科等疾病上都有廣泛的應用，主要用于治療痛經、糖尿病周圍神經病變、腫瘤、腎病、慢性肺源性心臟病、胃炎和蕁麻疹等疾病^[3-10]。方中桂枝辛溫，溫經散寒以通脈，與當歸共為君藥；白芍、細辛共為臣藥，助桂枝溫通血脈。桂枝來源于樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl. 的干燥嫩枝，味辛、甘，性溫，具有發汗解肌、溫通經脈、助陽化氣、平沖降氣之功效，主要用于風寒感冒、脘腹冷痛、血寒經閉、關節痹痛、痰飲、水腫、心悸、奔豚等癥^[11]。研究表明，桂枝在臨床上一般用于治療腫瘤、類風濕關節炎、痛經、糖尿病周圍神經病變、心血管、痙攣等疾病^[12-14]。

中藥質量標志物(Q-marker)是劉昌孝院士^[15-16]于2016年針對中藥生物屬性、制造過程及配伍理論等特點提出的新概念，是中藥質量評價與控制的核心概念。Q-marker具有有效性、特有性、傳遞與溯源性、可測性和處方配伍“五原則”的特點，能夠反映中藥的安全性和有效性，有利于建立中藥全程質量控制及質量溯源體系。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，具有整體性和模糊性的特點，能夠反映中藥及其制劑內在質量的穩定性和均一性，是控制水煎液、復方制劑等失去中藥外表特征的中藥制劑的有效手段^[17-18]。中藥和復方制劑成分復雜，具有多成分、多靶點及多通路的特點，使其作用機制研究困難。網絡藥理學具有系統性與整體性的特點，運用網絡藥理學對中藥進行系統分析，有助于反映及闡釋中藥的活性成分與靶點之間的作用關系^[19-22]。本研究通過建立桂枝水煎液和DSD的指紋圖譜，采用指紋圖譜和網絡藥理學相結合的方法分析預測DSD中桂枝的Q-marker，為全面控制DSD的質量提供依據，為進一步研究DSD的作用機制提供參考，同時為經典名方中復方與單味藥的Q-marker的關聯性研究提供示范。

1? 儀器與試藥

1.1? 儀器

Waterse 2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動進樣器、PDA檢測器和Empower工作站(美國Waters公司)；MS-105D型1/10萬電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TD5001C型電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；H1650-W型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2? 試藥

桂皮醛(批號SSELDLI，質量分數＞98%)購自東京化成工業株式會社；肉桂酸(批號AA0807DA14，質量分數≥98%)、桂皮醇(批號Y04N7C23850，質量分數≥98%)、香豆素(批號Y29M9C57109，質量分數≥98%)、原兒茶酸(批號H21J9Z64031，質量分數≥98%)、2-甲氧基肉桂酸(批號RA0424FA14，質量分數≥98%)、2-甲氧基桂皮醛(批號S28D9G78359，質量分數≥98%)均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；其他試劑均為分析純。

DSD由當歸、桂枝、白芍、細辛、甘草、木通和大棗7味藥組成，均購自于道地產區或主產區。每味藥共收集不少于3個產地，總批次不少于15批。本實驗前期已按照《中國藥典》2015年版項下各味藥的檢測方法和檢測要求對藥材進行檢測，選出優質產地的藥材，并按照《中國藥典》2015年版項下炮制方法將藥材炮制成飲片。當歸(甘肅岷縣，批號TA180074001)；桂枝(廣西東興，批號TA180185001～TA180199001)；白芍(安徽亳州，批號TA180099001)；細辛(遼寧新賓，批號TA180145001)；甘草(甘肅隴西，批號GC17111412)；木通(河南洛陽，批號MT2019030505)；大棗(山西聞喜，批號DZ1807162)。經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定分別為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels. 的干燥根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl. 的干燥嫩枝、毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall. 的干燥根、馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoidesFr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag. 的干燥根和根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch. 的干燥根和根莖、木通科植物木通三葉木通Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz. 的干燥藤莖和鼠李科植物棗Ziziphus jujuba Mill. 的干燥成熟果實。本實驗共研究桂枝和DSD各15個批次。

2? 方法與結果

2.1? 色譜條件

色譜柱：Merck Purospher Star LP RP-₁₈ endcapped(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～8 min，5%～10% A；8～15 min，10%～13% A；15～24 min，13%～15% A；24～28 min，15%～17% A；28～32 min，17%～20% A；32～40 min，20%～30% A；40～47 min，30%～45% A；47～60 min，45%～70% A；60～75 min，70%～95% A；體積流量1.0mL/min；檢測波長270nm；柱溫30 ℃；進樣量10μL。

2.2? 對照品溶液的制備

分別取桂皮醛、肉桂酸、香豆素、原兒茶酸、桂皮醇、2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基肉桂酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，得到質量濃度分別為0.300、2.525、2.250、0.613、0.325、1.473、0.316 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3? 樣品的制備

DSD出自于東漢?張仲景《傷寒論》，原方組成：“當歸三兩，桂枝三兩(去皮)，芍藥三兩，細辛三兩，甘草二兩(炙)，通草二兩，大棗二十五枚(擘)”。用法用量：“上七味，以水八升，煮取三升，去滓，溫服一升，日三服”。經文獻資料考證，按一兩等于3 g，大棗二十五枚為8枚(約62.5 g)，一升等于200 mL，稱取處方藥味置陶瓷鍋中，加水1 600 mL，加蓋，武火煮沸并保持微沸煎至600 mL，以80目篩網濾過，絞渣，即得。按照煎煮方法，煎煮得到15批DSD(編號D1～D15)、15批桂枝水煎液(編號S1～S15)和1批缺桂枝陰性水煎液(編號YX)。

2.4? 供試品溶液的制備

分別取桂枝水煎液、DSD和缺桂枝陰性水煎液搖勻，精密量取3 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5? 方法學考察

2.5.1? 參照峰選擇? 肉桂酸是桂枝的主要成分之一，化學性質穩定，峰面積較大，色譜峰保留時間穩定，故選擇肉桂酸作為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。

2.5.2? 精密度試驗? 取DSD(D1)，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果顯示共有峰的相對峰面積RSD＜2.8%，相對保留時間RSD＜0.14%，表明儀器精密度良好。

2.5.3? 穩定性試驗? 取DSD(D1)，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果顯示共有峰的相對峰面積RSD＜3.0%，相對保留時間RSD＜0.54%，表明DSD在48 h內穩定性良好。

2.5.4? 重復性試驗? 取DSD(D1)，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果顯示共有峰的相對峰面積RSD＜3.0%，相對保留時間RSD＜0.11%，表明該方法重復性良好。

2.6? 指紋圖譜的建立與相關性分析

2.6.1? 桂枝水煎液和DSD指紋圖譜的建立? 取15批桂枝水煎液和15批DSD，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012年版)，分別以S1和D1為參照圖譜，采用中位數法，得到15批桂枝水煎液和15批DSD的指紋圖譜疊加圖，結果見圖1、2。

2.6.2? 桂枝水煎液和DSD相似度分析? 將15批桂枝水煎液和15批DSD的指紋圖譜均導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012年版)，計算相似度，結果見表1。15批桂枝水煎液和15批DSD的指紋圖譜相似度均＞0.96，表明桂枝水煎液和DSD的質量穩定均一。

2.6.3? 共有峰的指認及相關分析? 根據指紋圖譜分析結果，將DSD、桂枝水煎液、缺桂枝陰性水煎液和混合對照品的指紋圖譜進行疊加，結果見圖3。由圖可知，桂枝水煎液共確定10個共有峰，DSD共確定29個共有峰，經對照品指認其中7個共有峰。7個共有峰分別為4號峰(原兒茶酸)、17號峰(香豆素)、20號峰(桂皮醇)、21號峰(肉桂酸)、22號峰(2-甲氧基肉桂酸)、23號峰(桂皮醛)和26號峰(2-甲氧基桂皮醛)。由于復方成分復雜，17號峰(香豆素)未達基線分離，19號峰和22號峰(2-甲氧基肉桂酸)在缺桂枝陰性水煎液中存在一定干擾。

2.7? 基于“成分-靶點-通路”的網絡藥理學分析

2.7.1?中藥靶點預測? 通過檢索中藥系統藥理數據庫(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、PubChem Compound數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)中香豆素、原兒茶酸、桂皮醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛7個候選化合物的作用靶點，共得到與7個化合物相關的116個靶點。2.7.2蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡構建將篩選出的116個靶點，導入在線STRING 11.0數據庫軟件(https://string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI網絡分析，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數評分值為“high confidence＞0.7”，隱藏網絡中無聯系的節點，其余參數設置不變，獲得核心靶點PPI網絡圖(圖4)，結果共獲得116個節點，199條邊。將PPI結果以TSV文本格式導入Cytoscape 3.7.1軟件中，并利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲屬性分析，計算選取“度值”(degree)，“介數中心性”(betweennesscentrality)和“接近中心性”(closenesscentrality)3個重要拓撲參數均大于中位數且degree≥9的靶點作為核心靶點。經篩選得到12個核心靶點，結果見表2。經分析發現，這12個靶點與肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛、香豆素和原兒茶酸6個成分有關。

2.7.3? GO功能富集分析和KEGG通路富集分析? 利用David 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對12個潛在的核心靶點進行基因本體(GO)功能和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析主要包括基因產物細胞功能、分子功能和生物功能分析，對基因進行注釋和分類；KEGG通路富集分析可以得到DSD中桂枝核心靶點的信號通路。GO和KEGG分析均根據P＜0.05表示具有統計學意義。

GO富集分析共獲取24個GO條目，其中生物過程(BP)占16個、分子功能(MF)占4個、細胞組成(CC)占4個，根據顯著性程度P＜0.05進行部分展示。BP主要富集在白細胞介素-12生物合成過程的正調控、神經遞質分解代謝過程、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應等；MF主要富集在血紅素結合、鐵離子結合、氧化還原酶活性等；CC主要富集在細胞質核周區。結果見表3。KEGG富集分析共得到26條通路，根據顯著性程度P＜0.05，篩選得到15條相關通路，主要包括類固醇激素生物合成、化學致癌、酪氨酸代謝、色氨酸代謝等。結果見表4。

2.7.4? 成分-靶點-通路網絡構建? 根據篩選得到的6個成分、12個靶點和15條通路，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡圖，結果見圖5。根據Cytoscape 3.7.1軟件對網絡圖進行分析，以化合物、靶點蛋白、信號通路的連接度為參考，發現肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛、原兒茶酸的連接度相對較高，均可能是桂枝發揮藥效的活性物質；MAOA、MMP9、TLR4、CYP1A2、PTGS2、CYP1B1、RELA的連接度較高，可能是桂枝發揮作用的關鍵靶點；15條信號通路的連接度差異不大，均可能是桂枝的關鍵信號通路。

3? 整合分析

本研究通過建立桂枝水煎液和DSD的指紋圖譜，指認其共有峰，對指認出的成分進行網絡藥理學分析，篩選得到桂枝的關鍵靶點和信號通路，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡圖，根據degree分析肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛和原兒茶酸5個成分均可能是桂枝發揮作用的活性成分。基于Q-marker的“五原則”進行分析，其中2-甲氧基肉桂酸在缺桂枝陰性水煎液圖譜中存在一定干擾，原兒茶酸是桂枝和白芍的共有成分，肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛是桂枝的特有成分。結合指紋圖譜和網絡藥理學對DSD中桂枝的Q-marker進行預測分析，初步預測桂皮醛、肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛是DSD中桂枝潛在的Q-marker。

桂枝揮發油含量較高，主要成分為桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛，其他有效成分為肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、桂皮醇、香豆素、β-谷甾醇、多聚體糖苷及多種二萜類化合物等^[23]。經研究發現，桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抗癌等作用；肉桂酸具有抗炎、抗菌、抗腫瘤和抗氧化能力等作用^[13,24]。Chao等^[25]經過研究發現桂枝揮發油能夠減輕炎癥反應，其作用于NF-κB通路，通過減輕炎癥因子的產生來發揮作用。Ka等^[26]經過研究發現桂皮醛能夠抑制人類早幼粒細胞白血病HL-60細胞，誘導細胞凋亡。臨床研究表明，桂枝一般用于治療腫瘤、類風濕關節炎、痛經、糖尿病周圍神經病變、心血管、痙攣等疾病^[12-14]。利用BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/ batman-tcm/)查找發現DSD可通過調控TNF信號通路、HIF-1信號通路、5-羥色胺能突觸、酪氨酸代謝、類固醇激素生物合成、癌癥通路、色氨酸代謝、NF-κB信號通路、多巴胺能突觸等信號通路進行疾病治療。程邦^[27]經研究發現DSD通過調控TNF信號通路、HIF-1信號通路、癌癥通路等信號通路干預類風濕性關節炎；程思宇^[28]經研究發現DSD通過調控NF-κB信號通路治療糖尿病周圍神經病變；劉澤宇等^[29]經研究發現DSD通過調控TNF信號通路、HIF-1信號通路等信號通路治療肝細胞癌。綜上分析，推測TNF信號通路、HIF-1信號通路、癌癥通路、5-羥色胺能突觸、酪氨酸代謝、類固醇激素生物合成、色氨酸代謝、多巴胺能突觸和NF-κB信號通路均可能是桂枝在DSD中發揮作用的信號通路。

4? 討論

中藥和復方制劑成分復雜，具有多成分、多靶點、多通路的特點，使其作用機制研究困難。中藥指紋圖譜是建立在中藥化學成分系統研究的基礎上，分析中藥和復方制劑的化學成分類型，對中藥進行整體質量控制；網絡藥理學基于疾病、基因、靶點、中藥相互作用網絡的基礎上，進一步闡釋中藥的作用機制；質量標志物是中藥質量評價與控制的指標，有利于建立中藥全程質量控制及質量溯源體系。

本研究依據劉昌孝院士^[16]提出的“質量標志物”的理念，采用指紋圖譜和網絡藥理學相結合的方法分析預測DSD中桂枝的Q-marker。通過建立桂枝水煎液和DSD的指紋圖譜從傳遞和溯源性、可測性的角度對桂枝進行分析，指認出原兒茶酸、香豆素、桂皮醇、肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛7個成分，其中桂皮醇未達基線分離，2-甲氧基肉桂酸在缺桂枝陰性水煎液的指紋圖譜中存在一定干擾；運用網絡藥理學從有效性的角度對其進行分析，發現肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基桂皮醛、桂皮醛和原兒茶酸5個活性成分通過調控MAOA、MMP9、TLR4、CYP1A2、PTGS2、CYP1B1、RELA等關鍵靶點，作用于TNF信號通路、HIF-1信號通路、癌癥通路、NF-κB信號通路、酪氨酸代謝等關鍵信號通路發揮桂枝治療疾病的功效；從質量標志物特有性的角度進行分析，原兒茶酸是白芍和桂枝的共有成分，桂皮醛、肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛是桂枝的特有成分。綜上所述，初步預測桂皮醛、肉桂酸和2-甲氧基桂皮醛為DSD中桂枝潛在的Q-marker。為后期深入研究桂枝和DSD的作用機制提供參考，有助于建立全程質量控制體系，提高中藥產業質量控制水平。

參考文獻(略)?

來? 源：? ?夏金鑫，梅? 茜，郭? 爽，嚴國俊，王巧晗，季? 德，趙曉莉，陸兔林，毛春芹. 基于指紋圖譜和網絡藥理學對當歸四逆湯中桂枝的Q-marker預測分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2634-2633.

總結

以上是生活随笔為你收集整理的指纹图谱相似度评价软件_基于指纹图谱和网络药理学对当归四逆汤中桂枝的Qmarker预测分析...的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網站內容還不錯，歡迎將生活随笔推薦給好友。