在《誰發明了Western-Blotting？》中我們提到，Western-Blotting（WB）起源于核酸印跡——Southern Blotting和Northern Blotting，二者的基本原理是通過瓊脂凝膠，將分子量不同的DNA和RNA分離，然后轉膜及用特異性探針檢測。與其類似，目前被廣泛應用的WB方法也是用SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白分離，然后用特異性抗體（一抗和二抗）檢測特定的蛋白。之所以能用WB檢測目的蛋白，其核心理論就是特異性抗體與目的蛋白之間的抗原抗體特異性反應。本質上講，WB所用的特異性一抗二抗和我們要檢測的目的蛋白都屬于蛋白質。

抗原抗體反應是指抗原與相應抗體之間所發生的特異性結合反應。這種反應既可在機體內進行，也可以在機體外進行。在機體內，當免疫細胞被抗原激活后，由B細胞分化成熟為漿細胞后所合成、分泌的一類能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白（immunoglobulin，Ig），激活補體系統從而解除抗原對機體的損傷。

Ig是由兩條相同的輕鏈（L鏈）和兩條相同的重鏈（H鏈）通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈“Y”字型結構。每條L鏈由可變區（variable region）和恒定區（constant region）組成；每條H鏈也有可變區和恒定區組成，其中恒定區可分為三個結構域。從N-端起，H鏈的1/4肽段及L鏈的1/2太短在各類Ig的排列順序可變性大，稱為可變區（V區），其功能是決定不同Ig與抗原結合的特異性。Ig可分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五類，IgG分子結構圖見下。由于抗原、抗體在結構上具有相互識別相互嵌合的構象，抗原分子表面具有抗原決定簇（抗原表位）可與抗體分子的超變區中溝槽分子表面的抗原結合點之間在化學結構和空間結構上是互補關系，所以抗原抗體結合反應是特異性的（見圖）。本段內容、IgG分子結構圖及抗原-抗體的特異性反應圖摘自《生物化學與分子生物學 第9版_周春燕、藥立波主編2018年》。

影響抗原-抗體特異性結合的影響因素包括：

1、酸堿度：抗原抗體特異性結合的最適酸堿度pH 6.0-8.0；

2、電解質：電解質可以影響溶液pH，也可影響蛋白質的等電點；

（因此，WB的洗膜緩沖液，均用PBS/PBST或TBS/TBST等平衡鹽液體，抗體稀釋液和封閉液也多是上述液體配置，是為了保證抗原抗體反應的最佳條件）

3、溫度：一般為15-40℃，最適為37℃；

（常用的一抗孵育時間為：室溫，2-3h；二抗孵育時間：室溫，1h。此外，4℃過夜封閉也應用廣泛，這與抗原抗體反應的反應特點有關，涉及抗原抗體的結合率）

抗原抗體反應的主要特點有：

1、特異性：特定的抗體只能與特定的抗原（肽段/蛋白）結合，這在WB一抗二抗的種屬及反應性的選擇常用到；

2、比例性：抗原抗體在整個反應中存在一定的量比關系，只有當二者濃度比例適當時才出現可見反應；WB中蛋白上樣量和一抗二抗的稀釋比例與此有關，實際操作中抗體的量相對較多，這也是為何抗體可以反復使用的原因之一；

3、可逆性：抗原抗體的結合是非共價結合，在一定條件下這種非共價結合是可逆的；因此，同一NC膜/PVDF膜在Stripping（抗體洗脫）以后可以用來檢測其他蛋白；

4、階段性：抗原抗體特異性反應分兩階段，第一階段反應迅速，第二階段反應緩慢，兩階段均為特異性結合；WB中抗原抗體結合在室溫下，反應1小時結合率可達95%，2小時可達97%以上；4℃在，反應4-6小時可達90%，8小時可達95%（本人忘記了具體的數值，但大致如此）。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的3蛋白wb_【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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