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【分子】DNA的提取與檢測（下）——質粒DNA?mp.weixin.qq.com

愛米娜桑，大家好我們的分子生物學實驗又回來聊。我們繼續DNA的提取故事，就很舒服。今天我們來看質粒這個小寶寶，愛，就是它~~~

三、堿裂解法提取大腸桿菌質粒DNA

【實驗原理】

堿裂解法提取質粒是利用共價閉合環狀質粒DNA（cccDNA）與基因組DNA在拓撲結構上的差異性將其分離的過程。

當pH=12.0-12.5時，線狀DNA變性，此時cccDNA氫鍵雖然打開，但兩條互補鏈仍然彼此結合。

當加入pH=4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液使體系pH降低后，cccDNA復性，而基因組DNA不能迅速準確復性。

通過離心，使基因組DNA、蛋白質-SDS復合物、大分子RNA等共沉淀，而質粒DNA仍然留在上清液中。

【實驗試劑】

【實驗流程】

①細胞擴增

以pETBlue-2質粒為例，抗性為羧芐青霉素（Carb）與四環素（Tet）。

于3 mL LB液體培養基中依次加入5 mg/mL Tet 7.5 μL（終濃度12.5 μg/mL）與50 mg/mL Tet 3 μL（終濃度50 μg/mL），之后接入含有pETBlue-2質粒的大腸桿菌單菌落。37℃，190 rpm/min，振蕩培養過夜（12-16 h）。

②細胞破碎與粗提

將菌液搖勻后，加入1.5 mL離心管中，室溫下，4000 rpm離心1 min，吸干上清液，使菌體盡可能干燥。剩余菌液同樣操作，同一管菌液收集在同一個離心管中。

加入100 μL Solution I，充分吹打混勻，使細胞重懸，不能有結塊，室溫放置10 min。

加入200 μL Solution II（新配），輕柔混勻，室溫放置3-5 min，使溶液清亮。注意時間不能過長，動作不能過大，否則易使基因組DNA斷裂。

加入150 μL Solution III（預冷），輕柔混勻，使Solution III在粘稠的細菌裂解物中均勻分散。之后冰浴15 min，使質粒DNA復性。

4℃，12000 rpm/min離心10 min，將上清轉移至另一1.5 mL離心管中。

③純化與濃縮

向上清中加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25:24:l）抽提，去除蛋白質和脂質，渦旋混勻，4℃，12000 rpm/min離心5 min，將上清轉移至另一1.5 mL離心管中。

向上清中加入等體積氯仿-異戊醇（24:l），去除酚和脂質，渦旋混勻，4℃，12000 rpm/min離心5 min，將上清轉移至另一1.5 mL離心管中。

向上清中加入2倍體積無水乙醇，渦旋混勻，冰浴30-60 min，使DNA沉淀。4℃，12000 rpm/min離心10 min，吸去上清。

用1 mL 70％乙醇洗滌質粒DNA兩次，每次振蕩混勻后，4℃，12000 rpm/min離心5 min，吸去上清，空氣干燥。

加入20 μL RTE或ddH2O使質粒完全溶解，檢測濃度后，-20℃保存。

四、DNA產物電泳檢測

總結

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