實(shí)驗(yàn)材料

構(gòu)建的群體，或自然群體，如各地方品種。

RAD文庫(kù)構(gòu)建

提取DNA后，構(gòu)建文庫(kù)，簡(jiǎn)要步驟如下：
① 限制性?xún)?nèi)切酶TaqＩ酶切；
② 連接P1接頭；
③ DNA隨機(jī)打斷片斷化；
④ 目的片段回收與末端修復(fù)；
⑤ 連接P2接頭；
⑥ RAD片段富集；
⑦ 上機(jī)測(cè)序。
參考：Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD) markers

測(cè)序reads過(guò)濾

根據(jù)識(shí)別標(biāo)簽序列得到每個(gè)個(gè)體的測(cè)序reads，使用trimmomatic進(jìn)行過(guò)濾（其他質(zhì)控軟件，如fastqc，multiQC等）
設(shè)置過(guò)濾參數(shù)為：SLIDINGWINDOW:5:20 LEADING:5 TRAILING:5 MINLEN:50。 過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)：兩端質(zhì)量低于5的堿基進(jìn)行切除，并以5bp為窗口進(jìn)行滑動(dòng)過(guò)濾，對(duì)平均質(zhì)量低于20的窗口進(jìn)行切除。

比對(duì)和變異檢測(cè)

BWA （其他比對(duì)軟件如bowtie2/soap2/MAQ等）將過(guò)濾后的個(gè)體clean reads比對(duì)到參考基因組序列上。樣本比對(duì)率反映的是樣本測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的相似性，覆蓋深度和覆蓋度能夠直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)的均一性與參考序列的同源性。

使用GATK（或samtools+bcftools)Haplotype Caller模塊進(jìn)行變異檢測(cè)，獲得群體變異集文件（VCF 格式）。對(duì)變異進(jìn)行過(guò)濾：過(guò)濾參數(shù)為缺失率小于或等于0.2、雜合率小于或等于0.2、最小等位基因頻率（MAF） 大于或等于0.05，最終得到高質(zhì)量的基因型數(shù)據(jù)。

聚類(lèi)分析

群體分析三幅圖：群體結(jié)構(gòu)圖（祖先成分堆疊圖）、PCA、系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

在獲得高質(zhì)量的標(biāo)記數(shù)據(jù)以后，利用vcftools將vcf文件處理得到plink.ped和plink.map文件（整理為plink軟件所需格式）。

使用plink 軟件隨機(jī)選擇連鎖不平衡（LD）小于0.1，且相鄰間隔在300kb以上的SNP位點(diǎn)，最后得到一個(gè)包含3420 個(gè)SNP位點(diǎn)的標(biāo)記集，一般是生成.bed文件。

1.祖先成分堆疊圖
使用ADMIXTURE對(duì)此 SNP位點(diǎn)集（bed文件）進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析（Structure），利用交叉驗(yàn)證過(guò)程確定確定合適的祖先數(shù)或亞群（K值）。若不知道理想的K值，可用ADMIXTURE計(jì)算，一般當(dāng)cross-validation error值最低時(shí)所對(duì)應(yīng)的K值為最合適的K值。

考慮到樣本所歸屬的分類(lèi)單元，即看看哪幾個(gè)物種聚在一起，對(duì)合適的K值利用Structure軟件（速度慢，其他軟件如frappe，ADMIXTURE也可做群體結(jié)構(gòu)圖，并且很快）聚類(lèi)圖，一些R包如hapmap也是可以做群體結(jié)構(gòu)圖的。

2.PCA
利用GCTA對(duì)SNP數(shù)據(jù)集進(jìn)行樣本的PCA分析（其他軟件如EIGENSOFT中的smartpca）。GCTA可以直接讀取.bed , .bim , .fam文件，利用–make-grm 生成個(gè)體對(duì)之間的遺傳關(guān)系矩陣，并將GRM的下三角元素保存為二進(jìn)制文件.grm.id , .grm.bin ， .grm.N.bin。使用 –pca 設(shè)置要生成主成分的數(shù)目，一般來(lái)說(shuō)就可以刻畫(huà)出群體結(jié)構(gòu)。這一步會(huì)生成 .eigenval 和 .eigenvec 兩個(gè)文件。.eigenval文件為各主成分可解釋遺傳信息的比例，.eigenvec文件為每個(gè)樣本在top4主成分上的分解值。

3.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
構(gòu)樹(shù)的方法有非加權(quán)分組平均法（UPGMA，已經(jīng)很少用）、最小進(jìn)化法（ME）、鄰接法（NJ）、最大簡(jiǎn)約法（MP）、最大似然法（ML）等。

構(gòu)樹(shù)軟件如FastTree/MEGA/cluster X/phylip，美化可以用FigTree/ggtree/treeview/GraPhIAn。

NJ法是基于最小進(jìn)化原理經(jīng)常被使用的一種算法，它不檢驗(yàn)所有可能的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，能同時(shí)給出拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分支長(zhǎng)度。

GWAS的群體遺傳分析也是包含這三個(gè)圖，RADseq畢竟是簡(jiǎn)化基因組，得到的SNP有限，做這種群體分析效果肯定沒(méi)有GWAS好。

Ref：Admixture：一款快速分析群體遺傳結(jié)構(gòu)的軟件
群體結(jié)構(gòu)分析三種常用方法(下篇)
群體結(jié)構(gòu)分析三種常用方法 (上篇)
基于RAD高通量測(cè)序探討中國(guó)85種杜鵑花屬植物的分類(lèi)
http://www.360doc.com/content/17/1120/01/33459258_705424795.shtml

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的重测序（RADseq）做群体遗传分析套路的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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