今天分享一篇2021年6月份的文章，發表在Hepatology, IF:17.423。文章探索了伴有血管侵犯肝細胞癌的分子景觀，識別了由MYC癌基因驅動的不同轉錄、表觀遺傳和蛋白質組學變化；FN1蛋白組織高表達，血漿水平高表達及其侵襲遷移的生物學功能，并證實FN1作為潛在無創生物診斷標記物的臨床意義。文章內容復雜，環環相扣，讓我們看看它是如何完成的。

一、摘要

Background and aims:?血管侵犯(VI)是HCC復發和預后不良的一個重要危險因素。HCC中血管侵犯的分子驅動因素還有待研究。探索侵襲性HCC的分子景觀將有助于識別治療靶點和無創性生物標志物。

Approach and results:?本研究，使用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas; TCGA)數據。?在TCGA肝癌隊列（n = 373）中，5% (n = 17)的腫瘤存在大血管侵犯，25% (n = 94)的腫瘤存在微血管侵犯。?功能通路分析顯示，MYC癌基因是VI中mRNA、miRNA和蛋白質組學變化的共同上游調控因子。研究進行了侵襲性的人源性HCC和MYC驅動的小鼠源性HCC的蛋白質組學比較分析，確定了纖維連接蛋白是侵襲性HCC的蛋白質組學生物標志物(小鼠纖維連接蛋白1 [Fn1]， P = 1.7 × 10-11;?人類FN1, P = 1.5 × 10-4)。?在機制上，研究發現FN1促進肝癌細胞的遷移和侵襲表型。通過一個獨立的人HCC組織芯片隊列證明了人HCC中纖維連接蛋白過表達(n = 153; P < 0.001)。?最后，相對于肝硬化患者，HCC患者血漿纖維連接蛋白水平顯著升高。????

Conclusions:研究探索了伴有血管侵犯肝細胞癌的分子景觀，識別了由MYC癌基因驅動的不同轉錄、表觀遺傳和蛋白質組學變化。MYC上調纖維連接蛋白FN1的表達，促進了HCC的侵襲性。此外，纖維連接蛋白FN1是伴血管侵犯HCC中的一種有前途的無創蛋白生物標志物。

二、流程圖

三、結果簡述

1.?血管侵犯是與肝癌復發相關的預后因素。

在TCGA隊列(n=373)中，血管侵犯(VI)存在于34.9%的腫瘤患者(n=111)，大血管侵犯存在于5.8% 患者(n=17)和微血管侵犯存在于29.1% 患者(n=94)。

腫瘤分期越晚期(I期為14%，II期為64%，III期為53%)(p=0.03)，更高的腫瘤分級(15%的低分級，46%的中/高分級)(p=0.03)，更高的血清甲胎蛋白水平(p=0.02)，HCC患者伴血管侵犯的患病率越高。

微血管侵犯(64%)和大血管侵犯(65%)腫瘤的復發率高于無血管侵犯(45%)的腫瘤。

(p < 0.001）。

與沒有血管侵犯的HCC患者相比，存在大血管侵犯HCC患者預后較差。與無血管侵犯的HCC患者相比，存在微小或大血管侵犯的HCC患者無復發生存期明顯較短。總之，HCC中存在血管侵犯與侵襲性腫瘤行為和不良預后密切相關。

為了確定人類HCC中驅動血管侵犯的基因組事件，研究首先比較了有或沒有血管侵犯的腫瘤突變譜。TP53突變在血管侵犯腫瘤中的發生率(37.5%)高于無血管侵犯腫瘤的發生率(25%)。(p = 0.03)。與無血管侵犯的HCC患者相比，染色質結構的調節因子HIST1H1C的突變幾乎只存在于血管侵犯的HCC患者中（4.8%vs0.5%,p=0.01）。

此外，在有無血管侵犯的HCC患者之間，沒有發現任何顯著的拷貝數差異，拷貝數變之間具有相似性。

因此，目前的研究結果并沒有揭示伴血管侵犯的HCC腫瘤中基因型與表型之間的關系，這促使進一步研究轉錄組學和蛋白質組學的景觀。

2.?伴有血管侵犯的HCC轉錄組景觀。

研究進一步分析了HCC的轉錄譜，以識別血管侵犯腫瘤中失調的基因和通路。研究識別出102個差異表達基因，其中92個基因高表達，10個基因低表達。

將血管侵襲相關基因標記與已發表的HCC預后基因標記進行比較，研究發現在HCC中與不良預后相關的基因類富集，如Hoshida亞類S1，Boyault G3亞類和Woo肝癌復發特征等。

研究進行了上游調控途徑分析，以確定全局轉錄變化的基因組驅動因素。最終識別出MYC (p=9.8 x 10-4)， CREBZF (p=2.0 x 10-3)， HOXD13 (4.2 x . 4)，ATF4 (5.0 x 10-3)和ZBTB17 (5.02 x 10-3)是血管侵襲相關轉錄組中最重要的上游調控因子。通過證明血管侵襲相關基因標記與之前報道的其他幾個MYC基因標記顯著重疊，進一步證實MYC是這一表型的重要轉錄調控因子。

對于microRNA而言, 研究鑒定了70個microRNA，這些microRNA在血管侵犯的腫瘤中有差異表達，其中23個過表達，47個低表達。前10差異表達的microRNA及對應的靶基因展示如下。

其中的一些microRNA，如mir-122、mir-21和mir-100，此前已被證實與HCC發病機制有關。這些數據證明了microRNAs如何可能使腫瘤轉向更具侵襲性的表型。研究進一步分析上游調控因子分析，發現TP53 (p=1.4 X 10-10)、MYC (3.4 X 10-5)、CDKN2A (p=1.7 X10-4)、NPM1 (p=1.3 X10-4)和YBX1 (p=9.7 X10-4)是差異表達的血管侵犯相關microRNAs的前五大轉錄調控因子。

本研究通過對血管侵犯HCC腫瘤轉錄譜的分析揭示了與侵襲表型相關的基因和通路的富集，并確定了MYC癌基因作為HCC中血管侵襲的共同驅動因素（從mRNA,microRNA轉錄水平分析）。

3.?伴有血管侵犯的HCC 蛋白質組學改變的功能評估

考慮到蛋白質是細胞功能的最終效應器，為了進一步理解基因組和轉錄組變化的功能含義，研究分析了血管侵犯HCC腫瘤的蛋白質組學景觀。在有無血管侵犯的腫瘤中進行差異蛋白表達分析，共識別出87個差異表達蛋白。

血管侵犯HCC腫瘤中表達前10種蛋白參與了多種細胞功能，包括細胞黏附、凋亡和代謝等。

蛋白組學變化的功能通路分析揭示了細胞活力(p=6.4 × 10-39)、細胞遷移(p=4.1 × 10-31)、增殖(p=1.5 × 10-49)和血管生成等生物學過程(p=3.5x10-14)在血管侵犯HCC腫瘤中顯著上調，而凋亡(3.1x10-54)和衰老(7.7x10-15)等通路顯著下調。

研究評估了蛋白質組變化的上游轉錄調控因子。前5位調控因子分別為TP53 (p= 1.4 × 10-37)、MYC (p=8.7 × 10-24)、JUN (p=5.3 × 10-23)、E2F1 (4.3 × 10-22)和FOXM1 (p=1.7x10-19)。

同時，RB1通路、VHL通路等腫瘤抑制通路在血管侵犯腫瘤中顯著下調。因此，對HCC中與血管侵犯相關的蛋白質組學變化的功能分析描繪了侵襲性腫瘤表型的特征。

4.跨物種蛋白質組學分析表明，纖維連接蛋白是侵襲性HCC的生物標志物

本研究表明MYC癌基因是HCC中血管侵襲相關mRNA、microRNA和蛋白質組學變化的上游重要調控因子。利用MYC驅動的小鼠源性轉基因模型進一步探索血管侵犯HCC腫瘤特征。

研究進一步發現血管侵犯是小鼠MYC-HCC的一個高度普遍的特征 。

研究通過液相色譜-質譜法(LCMS)評估了與MYC-HCC相關的蛋白質組學變化景觀。與對照組小鼠肝臟相比，HCC腫瘤組織中含392個過表達蛋白，360個低表達蛋白。（此處為方便展示將此圖旋轉了90°）。

甲胎蛋白(AFP)， β-catenin，vimentin等分子在人類HCC中較高，但在MYC-HCC更高；氨甲酰磷酸合成酶1，酸性磷酸酶1和醛縮酶B等分子在人類HCC中較低，但在MYC-HCC中更低。

在MYC-HCC中，蛋白質組學變化的上游最顯著的調控因子被證實為MYC (p=8.2 X 10-79)。人HCC中其他基因組調控因子如Trp53 (4.1 X 10-53)和β-catenin (4.2 X 10-23)也被發現是MYC-HCC蛋白組學變化的重要上游調控因子，如下圖所示。

在生物功能上，如癌細胞遷移(p=6.9 X 10-8)和侵襲性(1.4 X 10-7)在小鼠MYC-HCC中被激活，從而證實MYC-HCC腫瘤具有侵襲性表型。

研究進行跨物種比較分析，以識別在MYC驅動的小鼠HCC (n=759)和伴有血管侵犯的人HCC (n=87)富集的共有蛋白，最終發現7種蛋白質在兩組之間重疊。

其中，纖維連接蛋白（FN1）在兩個隊列中都是過表達蛋白。蛋白印跡法(WB)進一步證實了纖維連接蛋白在MYC驅動的小鼠HCC中過表達。

免疫熒光表明在MYC-HCC的癌細胞和腫瘤間質中，纖維連接蛋白都被觀察到過表達。此外，基質FN1主要在血管周和瘤周部位表達，在MYC-HCC的IHC染色中，10%的癌細胞本身表達FN1。

研究發現FN1在MYC-HCC中過表達。隨后進一步發現MYC促進纖連蛋白FN1轉錄的機制證據。首先，Chip-seq實驗的meta分析顯示，MYC在該基因中與人類FN1基因上游結合。而后，motif 分析表明在真核啟動子數據庫(EPD)的數據中發現FN1啟動子區域有多個MYC結合位點。隨后，利用ENCODE數據庫，根據FN1轉錄起始位點附近MYC結合位點的存在，確定FN1為MYC的轉錄靶基因。最后，發現在TCGA泛癌數據庫中，包括HCC在內的13個實體瘤中，MYC水平與FN1水平呈正相關。（這些圖均在附圖，由于權限附件未能下載）。綜上所述，這些結果表明MYC在癌細胞中轉錄調控FN1的表達。

5. 纖維連接蛋白(FN1)促進人肝細胞癌的侵襲和遷移

研究首先評估了纖維連接蛋白在人類HCC中的功能作用，利用cancer dependency map data數據庫分析全基因組CRISPRi和RNAi來評估敲除纖維連接蛋白FN1影響肝癌細胞系的生存能力情況。在20個HCC細胞系中，所有細胞系在CRISPRi或RNAi篩選上的依賴評分均不低，表明FN1對肝癌細胞的存活或增殖不是必需的。

為了評估FN1在HCC中的功能作用，使用FN1敲低的兩種HCC細胞株SKHep1和sn182F，這兩種細胞株都有中性依賴評分。分別用qPCR和免疫熒光證實FN1 mRNA和蛋白的敲除效果。

由于在人類HCC中發現FN1與血管侵襲有關，本研究采用基底膜侵襲試驗評估FN1是否在癌細胞侵襲中發揮作用。研究結果表明FN1敲低的癌細胞通過基底膜的侵襲能力下降。

通過劃痕實驗，研究還發現FN1敲低的SKHep1細胞系遷移能力也下降。上述結果均表明FN1促進肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

6. 驗證人HCC中纖維連接蛋白組織表達

在TCGA隊列中，纖維連接蛋白FN1在腫瘤中的表達不僅與血管浸潤有相關性，而且FN1高表達與腫瘤分期晚(p=0.01)腫瘤分級高(p=0.08)，無瘤復發期短(p=0.001)（這些圖均在附圖，由于權限附件未能下載）。通過組織芯片進一步證實FN1的表達情況，肝細胞癌中FN1表達陽性的細胞百分比高于無肝細胞癌的肝硬化(25.3% vs. 17%， p=0.002)或對照組非肝組織(25.3% vs. 8.9%， p=0.01)。

此外，研究還評估了來自公共肝癌樣本庫的人類病理蛋白圖譜(HCPA)數據庫的纖連蛋白表達情況，與組織芯片結果具有一致性，HCC腫瘤中均表達了纖維連接蛋白，大多數(75%，n=9)中至高表達，25%低表達。這些數據證實了纖維連接蛋白在人類HCC中顯著過表達。

為了驗證FN1表達與血管侵犯HCC之間的關系，研究分析了已知血管侵犯的腫瘤(n=6)和無血管浸潤的腫瘤(n=6)的FN1表達差異和獨立隊列中人類HCC組織(n=12)中FN1的表達。兩組患者的原發性腫瘤分期和肝硬化病因相匹配。結果仍表明FN1在肝癌組織中高表達。

此外，研究發現FN1在微血管侵犯腫瘤中的表達高于無微血管侵犯的腫瘤(p = 0.001)。有趣的是，在血管侵犯的腫瘤微血管系統中，纖維連接蛋白FN1在腫瘤栓子中持續過表達。這些結果表明在人類HCC中，腫瘤FN1表達與血管侵犯相關。

6. 纖維連接蛋白（FN1）作為晚期HCC的非侵襲性生物標志物

最后，該研究評估了纖維連接蛋白FN1是否可以作為肝癌的非侵襲性血漿生物標志物。研究進行了一項試點病例對照研究，前瞻性招募了年齡、性別、種族和肝硬化病因相匹配的HCC患者(n=35)和無HCC肝硬化患者(n=10)。

與肝硬化對照組相比，HCC患者血漿纖維連接蛋白水平顯著升高。相比之下，在TCGA隊列中，另外兩種在HCC組織中高表達的蛋白PAI-1和VEGFR2在HCC患者血漿中沒有升高。AFP是HCC的一個已知的生物標志物，但在肝硬化患者之間沒有顯著差異。

FN1診斷HCC的靈敏度和特異性優于AFP。聯合AFP和FN1比單獨FN1 或單獨AFP 診斷HCC具有更佳的靈敏度及特異性。PAI-1和VEGFR2作為診斷指標效果不佳。

血漿FN1水平在多灶性HCC患者和晚期HCC患者更高。基于肝病的病因分組，血漿FN1水平沒有顯著差異。與組織纖連蛋白FN1表達一致的是，腫瘤侵犯血管的HCC患者血漿FN1水平高于未侵犯血管的HCC患者。

四、優缺點

當前的研究僅強調了具有血管侵犯的HCC腫瘤的獨特分子特征，然而本研究進一步深入分析了這種臨床相關的、侵襲性的HCC亞型。具有良好的創新性，補充空白。最終該研究確定MYC癌基因是這種血管侵犯HCC表型的主要驅動因素，并提出纖維連接蛋白FN1是侵襲性HCC的一個有前景的無創診斷預測因子。具有極佳的臨床意義。總之，本文章深入探究了血管侵犯肝細胞癌的分子特征，識別了癌基因MYC的重要作用，揭示了FN1的分子表達及生物學機制，并證實FN1可作為潛在無創診斷分子標記物的臨床價值。

最后Ps:? 我們在B站還有優質文章分享視頻哦~,希望大家多多關注。

往期精品(點擊圖片直達文字對應教程)

機器學習

后臺回復“生信寶典福利第一波”或點擊閱讀原文獲取教程合集

總結

以上是生活随笔為你收集整理的看生物信息学如何聚焦特定表型，探索分子机制，促进临床转化的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網站內容還不錯，歡迎將生活随笔推薦給好友。