生物信息學(xué)習(xí)的正確姿勢(shì)

NGS系列文章包括NGS基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)錄組分析?（Nature重磅綜述|關(guān)于RNA-seq你想知道的全在這）、ChIP-seq分析?（ChIP-seq基本分析流程）、單細(xì)胞測(cè)序分析?(重磅綜述：三萬字長(zhǎng)文讀懂單細(xì)胞RNA測(cè)序分析的最佳實(shí)踐教程 （原理、代碼和評(píng)述）)、DNA甲基化分析、重測(cè)序分析、GEO數(shù)據(jù)挖掘（典型醫(yī)學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)GEO數(shù)據(jù)分析 (step-by-step) - Limma差異分析、火山圖、功能富集）等內(nèi)容。

DNA是生命遺傳信息的載體，獲取DNA序列信息對(duì)于基礎(chǔ)科研和臨床診斷都至關(guān)重要。自1977年第一代測(cè)序技術(shù)問世以來，經(jīng)過四十余年的探索，DNA測(cè)序技術(shù)取得了重大進(jìn)展。隨著對(duì)測(cè)序成本降低的需求，以高通量為特點(diǎn)的第二代測(cè)序技術(shù)（NGS）應(yīng)運(yùn)而生并逐步成熟，以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的第三代測(cè)序技術(shù)也已經(jīng)誕生。DNA大規(guī)模平行測(cè)序已然成為基因組學(xué)研究和臨床診斷的重要工具

目前，能夠完成DNA大規(guī)模平行測(cè)序的平臺(tái)，除了基于邊合成邊測(cè)序原理的Illumina平臺(tái)和基于半導(dǎo)體測(cè)序法的Thermo Fisher平臺(tái)外，作為新興測(cè)序平臺(tái)代表的華大智造DNBSEQ平臺(tái)異軍突起，長(zhǎng)讀長(zhǎng)平臺(tái)Oxford Nanopore也呈飛躍式發(fā)展。

各家測(cè)序儀的“霸主之爭(zhēng)”由來已久，在人類和細(xì)菌基因組DNA層面的測(cè)序性能到底如何，不同的檢測(cè)需求又該如何進(jìn)行平臺(tái)選擇？到底應(yīng)該如何看待各個(gè)平臺(tái)的錯(cuò)誤模式？

近日，由生物分子資源設(shè)施協(xié)會(huì)（Association of Biomolecular Resource Facilities ，ARBF）支持的ABRF NGS II期研究成果發(fā)布于預(yù)印本平臺(tái)BioRxiv。此研究分析了在文庫(kù)制備和生物信息可控下，?各大測(cè)序平臺(tái)的數(shù)據(jù)，將平臺(tái)的性能和測(cè)序錯(cuò)誤模式一一揭示，為各大平臺(tái)的“霸主之爭(zhēng)”提供真實(shí)全面的參考依據(jù)。

1

ABRF?NGS II?期研究，規(guī)模宏大

ABRF于1989年正式組建，成員包括來自41個(gè)國(guó)家/地區(qū)、340個(gè)不同核心實(shí)驗(yàn)室的1000多位科學(xué)家，成員來自工業(yè)界、政府、學(xué)術(shù)界以及研究機(jī)構(gòu)。ABRF致力于通過研究、交流和教育推進(jìn)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的核心競(jìng)爭(zhēng)力和研究。

在ABRF NGS II期研究中，研究者在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，基于16款測(cè)序平臺(tái)，對(duì)一個(gè)人類基因組家族、三個(gè)單獨(dú)的菌株和十種細(xì)菌的宏基因組混合物測(cè)序，并將各平臺(tái)數(shù)據(jù)進(jìn)行多角度比較。

這些平臺(tái)包括6款I(lǐng)llumina平臺(tái)、3款ThermoFisher Ion Torrent平臺(tái)， 2款DNBSEQ平臺(tái)（BGISEQ-500和MGISEQ-2000）以及Oxford Nanopore平臺(tái)和Genapsys平臺(tái)等。數(shù)據(jù)分析包括各平臺(tái)的reads mapping能力，不同平臺(tái)的測(cè)序覆蓋度、復(fù)雜區(qū)域的測(cè)序錯(cuò)誤率、不同突變類型的檢出影響因素等。

圖1. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖：各大平臺(tái)數(shù)據(jù)質(zhì)量都較高，和參考基因組的比對(duì)率平均為96.1% (93.0–97.7%)

2

DNA水平測(cè)序數(shù)據(jù)分析

各大平臺(tái)各有千秋

基因覆蓋度分析

以25X均一化測(cè)序深度后，長(zhǎng)讀長(zhǎng)和短讀長(zhǎng)平臺(tái)的基因組覆蓋度均較好。

按照UCSC的 RepeatMask分類，DNA重復(fù)序列分為Alu、L1、L2、LTR、微衛(wèi)星、簡(jiǎn)單重復(fù)和端粒區(qū)域。測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于DNA重復(fù)序列的檢測(cè)，平臺(tái)各有所長(zhǎng)：BGISEQ-500、HiSeq4000?、NovaSeq 2x150bp在捕獲Alu區(qū)域時(shí)具有優(yōu)勢(shì)，HiSeq 2500、HiSeq X10和NovaSeq 2x150bp在捕獲L1、L2和低復(fù)雜度區(qū)域表現(xiàn)最佳，PacBio CCS和NovaSeq在微衛(wèi)星區(qū)域和簡(jiǎn)單重復(fù)區(qū)域的測(cè)序中表現(xiàn)最好， PromethION平臺(tái)的特長(zhǎng)則在端粒區(qū)域的捕獲。?

圖2. 各測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)基因覆蓋情況分布：a.25X平均測(cè)序深度下，UCSC RepeatMask的覆蓋情況；b.基因組平均覆蓋度與所有其他平臺(tái)平均覆蓋度

測(cè)序錯(cuò)誤率

分析結(jié)果顯示，測(cè)序錯(cuò)誤率與基因組GC含量具有直接相關(guān)性。在GC含量比較高的區(qū)域(75%-100%)，各平臺(tái)的錯(cuò)誤率均比較高。就錯(cuò)誤模式而言，華大智造的DNBSEQ平臺(tái)和Illumina平臺(tái)更傾向于核苷酸替代，而且這兩個(gè)平臺(tái)比較，靈敏度相當(dāng)，但華大智造的精度略好；Genapsys平臺(tái)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)平臺(tái)最主要錯(cuò)誤來源是插入/缺失。

圖3. 按UCSC-RepeatMask區(qū)域的各平臺(tái)的測(cè)序錯(cuò)誤率：(a)跨GC-windows的錯(cuò)誤檢出類型；(b)條形圖顯示各區(qū)域類型的總平均錯(cuò)誤率；(c)均聚物(n=72，687)和短串聯(lián)重復(fù)序列(n=928，143)區(qū)域的錯(cuò)誤率

SNV和INDEL突變檢測(cè)

SNV（單核苷酸變異）和INDEL（插入/缺失突變）是生物DNA常見的突變類型。

在SNV的檢出中，?華大智造的DNBSEQ平臺(tái)最為靈敏，其次是NovaSeq 2x250bp、NovaSeq 2x150bp、HiSeq 2500、HiSeq X10和HiSeq4000平臺(tái)。對(duì)INDEL的檢出中，所有平臺(tái)靈敏度均達(dá)到99.5%，華大智造的DNBSEQ平臺(tái)和NovaSeq的檢出相似，優(yōu)于其他平臺(tái)。PacBio、Nanopore平臺(tái)對(duì)于SNV和INDEL的捕獲能力均較弱。

圖4. 各平臺(tái)SNPs和 INDEL的檢出情況：(a)每個(gè)UCSC RepeatMask的SNP和INDEL檢出數(shù)量；(b)各平臺(tái)對(duì)SNP和INDEL突變檢出的靈敏性和特異性；(c)各平臺(tái)捕獲INDEL突變的片段大小分布

SV檢測(cè)

數(shù)據(jù)表明， SV（結(jié)構(gòu)變異）的檢出與多因素相關(guān)，如SV類型、測(cè)序平臺(tái)、實(shí)驗(yàn)室間的操作等。

在各平臺(tái)數(shù)據(jù)中，HiSeqX10檢測(cè)到SVs數(shù)量最多，其次是HiSeq4000和HiSeq2500。檢出假陽(yáng)性最多的平臺(tái)依次是HiSeq2500， HiSeqX10和HiSeq4000。

圖5. 基于不同平臺(tái)的SV檢出：a.測(cè)序反應(yīng)中，不同SV類型的檢出分布；b-d.關(guān)于SV突變檢出的多角度分析；b.測(cè)序平臺(tái)；c.實(shí)驗(yàn)室；d.多重突變；e.每100kbwindows的SV檢出。

細(xì)菌基因組的捕獲

此研究對(duì)于GC不平衡的原核細(xì)菌基因組進(jìn)行了測(cè)序分析，包括三種單一菌種和十種細(xì)菌的混合物，各樣本分別于MiSeq、Ion PGM和 Ion S5平臺(tái)測(cè)序。

細(xì)菌基因組捕獲的影響因素主要為菌種差異和測(cè)序平臺(tái)差異。在各個(gè)平臺(tái)中，ThermoFisher的Ion PM和 S5平臺(tái)在錯(cuò)誤率角度略勝一籌。對(duì)于復(fù)雜的宏基因組樣本，所有平臺(tái)都能夠識(shí)別混合物中的所有菌株，但對(duì)基因突變的捕獲水平差異較大。

圖6. 細(xì)菌基因組測(cè)序數(shù)據(jù)：a.基于各個(gè)平臺(tái)細(xì)菌基因組混合物的檢測(cè)結(jié)果，各菌種的類型和分布；b.宏基因組中各菌種占比；c.各個(gè)測(cè)序平臺(tái)，單一菌種和宏基因組混合物的測(cè)序錯(cuò)誤率

3

成熟平臺(tái)風(fēng)采依舊，新興平臺(tái)前景可期

ABRF NGS II期研究是迄今為止最全面的DNA測(cè)序分析研究之一，此研究跨越不同基因組大小和核苷酸組成，多角度分析揭示了測(cè)序平臺(tái)之間的特征差異，以及同一平臺(tái)的可變性和可重復(fù)性。

綜合各項(xiàng)數(shù)據(jù)，樣本的GC含量是影響測(cè)序錯(cuò)誤率的主要因素。對(duì)單一樣本的DNA測(cè)序而言，成熟的平臺(tái)如Illumina的表現(xiàn)依舊名列前茅，新興平臺(tái)的多項(xiàng)性能已經(jīng)和成熟平臺(tái)不相上下。但就特定區(qū)域如Alu的捕獲能力，對(duì)SNV、INDEL的檢出和錯(cuò)誤模式的評(píng)估，來自華大智造的DNBSEQ平臺(tái)，受益于其獨(dú)特的測(cè)序文庫(kù)方法學(xué)，已經(jīng)獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。

不可忽略的是，“對(duì)于宏基因組樣本，各平臺(tái)對(duì)樣本變異的捕獲能力差異較大，這表明在復(fù)雜背景下對(duì)于特定突變的捕獲，仍存在挑戰(zhàn)”， 論文作者、威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院Jonathan Foox教授如是說。

多年來，DNA大規(guī)模平行測(cè)序的市場(chǎng)一直由Illumina和ThermoFisher等寡頭壟斷。通過此研究，我們欣喜的發(fā)現(xiàn)，越來越多的新興測(cè)序平臺(tái)依托精益求精的性能指標(biāo)，在“霸主之爭(zhēng)”中不可小覷。

參考資料：

Jonathan Foox .et al，Multi-Platform Assessment of DNA Sequencing Performance using Human and Bacterial Reference Genomes in the ABRF Next-Generation Sequencing Study , bioRxiv ,2020,doi：https://doi.org/10.1101/2020.07.23.218602

• NBT|45種單細(xì)胞軌跡推斷方法比較，110個(gè)實(shí)際數(shù)據(jù)集和229個(gè)合成數(shù)據(jù)集

• 單細(xì)胞RNA-seq預(yù)處理工具比較分析（bioRxiv）

• 39個(gè)工具，120種組合深度評(píng)估 (轉(zhuǎn)錄組分析工具哪家強(qiáng))
  

往期精品(點(diǎn)擊圖片直達(dá)文字對(duì)應(yīng)教程)

后臺(tái)回復(fù)“生信寶典福利第一波”或點(diǎn)擊閱讀原文獲取教程合集

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的16款测序平台性能大PK，华大表现不俗！基于人类和细菌基因组DNA水平的多平台测序数据研究成果发布...的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。