往期回顧

醫學科研實驗基礎知識筆記（一）：細胞增殖

醫學科研實驗基礎知識筆記（二）：細胞凋亡檢測

醫學科研實驗基礎知識筆記（三）：細胞周期檢測

醫學科研實驗基礎知識筆記（四）：細胞自噬研究策略

醫學科研實驗基礎知識筆記（五）：血管新生

醫學科研實驗基礎知識筆記（六）：細胞衰老

醫學科研實驗基礎知識筆記（七）：腫瘤耐藥

醫學科研實驗基礎知識筆記（八）：磷酸化檢測

醫學科研實驗基礎知識筆記（九）：泛素化研究方法

甲基化的研究就分為 DNA 甲基化和組蛋白甲基化兩個細分問題。它們結果是一樣的， 都是影響基因的轉錄。DNA 甲基化是在 DNA 甲基轉移酶的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上的過程， 變成5-甲基胞嘧啶（甲基加在 5 號碳原子上， 真核生物只有這種甲基化修飾形式）。甲基化的功能主要是調控基因表達， 尤其在胚胎發育中甲基化控制著時序性表達的基因（時序性表達即在特定時間階段表達）， 甲基化去除之后就像基因解開封印， 用完之后再封印起來。在 DNA 甲基化的世界里， 大家重點搞清楚三件事：CpG 島、 甲基化和去甲基化過程中的酶以及甲基化特異性檢測方法。

CpG 島（CpG island） 是個術語， 是 DNA 發生甲基化的位置， CpG 里的 C 是 DNA 四種堿基之中的胞嘧啶的縮寫， p 代表磷酸， G 是堿基鳥嘌呤。CpG 即指 C 后面跟一個 G 的核苷酸序列， 而 CpG 島就是指富含 CG 序列的區域。基因組DNA 四種堿基排列， 從概率來說， CG 這種連續序列也是常見的排布。在人類基因組內， G和 C 的含量大約為 40%， A 和 T 比較多， 而且 GC 不是平均分布。在某些 DNA 片段位置，GC 局部富集， 而在另一些位置出現得較少。正常情況下， 散在的 CpG 是被甲基修飾的， 屬于封印狀態。在編碼基因的啟動子或者其他轉錄調控區域中，CpG 容易成簇，形成 CpG island。在健康人中 CpG 島跟散在的 CpG 不一樣， 它往往呈現非甲基化的狀態， 也就是解封印， 這是轉錄調控的開關。CpG 島有嚴格定義， 長度至少 500bp， GC 含量超過 55%， CpG 比值大于 0.65。CpG 比值是個參數， 有公式可以算的， 需要用到查一下。人類基因組大概存在 4 萬個 CpG 島， 大部分位于啟動子區域， 啟動子 CpG 島甲基化之后會誘發基因沉默， 所以啟動子 CpG 甲基化與轉錄活性呈負相關。CpG 島的概念之所以重要， 是因為研究一個基因啟動子 DNA 甲基化就是找 CpG 島位置， 那里是一切故事起源的地方。

第二個重要的概念是了解在甲基化和去甲基化過程中發揮作用的酶和輔助蛋白因子。甲基化是個可逆的酶促反應， 目前已知 DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase）有 4 種：DNMT1、DNMT2、 DNMT3a、 DNMT3b。根據結構和功能上的差異分為兩大類: 維持甲基化（maintenance methylation） 和從頭甲基化（de novo methylation）。維持甲基化以 Dnmt1 為代表， 它作用于僅有一條鏈甲基化的 DNA 雙鏈使其完全甲基化， 參與 DNA 復制雙鏈中的新合成鏈的甲基化。而從頭甲基化是對 DNA 鏈甲基化狀態的重構， 不依賴于 DNA 復制，是在完全非甲基化的位點上引入甲基。主要參與的從頭甲基化酶是 Dnmt3a、 Dnmt3b。現有研究表明 Dnmt1 與 Dnmt3a、Dnmt3b 之間還存在交互影響，并非絕對的分工關系。針對 Dnmt2的認識相對較少， 在 DNA 甲基化中不起主要作用， 所以平常研究中遇到的機會不多， 底物主要是催化 tRNA， 雖然底物不一樣但催化機制類似。除了 DNA 甲基化酶， 我們還需要注意有一類參與甲基化過程的 DNA 甲基化結合蛋白， 這類蛋白通過一種保守的結構域， 稱為甲基化 DNA 結合結構域（methylated DNA-binding domain， MBD）， 結合甲基化的 CpG。MBD 家族有 MeCP2， MBD1、 2、 3、 4 五個成員。MeCP2 是最早發現的， 甲基化與組蛋白乙酰化之間的聯系就通過它。MBD 識別甲基化位點， 負責招募阻遏蛋白， 抑制轉錄過程。有些轉錄因子直接對甲基化位點敏感的， 有甲基化存在就不能結合啟動子來影響轉錄。還有一些轉錄因子對甲基化不敏感， 當啟動子上存在 CpG 島的甲基化， 它們的轉錄抑制就需要MBD 參與。DNA 去甲基化過程比較復雜， 有脫氨酶參與的堿基切除修復途徑（base excision repair， BER）， 還有直接移除甲基化 CpG 的核苷酸切除修復機制（nucleotide excision repair，NER）， 也可以在酶催化下， 氧化或者水解方式去除甲基基團。

要知道 DNA 甲基化是增加了或是減少了涉及第三個問題：甲基化特異性檢測方法。作為一個研究歷史很長的修飾方式， 甲基化的實驗檢測方法非常多， 少說十幾種， 不過我理了一下，主要有兩類：第一類是酶切法， 原理是有些核酸內切酶能夠識別特異性的甲基化位點， 它們切割完 DNA 跑下膠鑒定結果就出來了， 再進一步可以用酶切+PCR 的方法鑒定。如果酶切完用電泳方法分離， 再用特異性探針進行雜交， 這方法就叫 Southern Blotting， 酶切法里大家記住 Southern 就好了， 既有跑膠分離又有特異性探針的雜交， 實驗精度更可靠， 一度還比較流行。這里 Southern 是檢測 DNA 的印跡雜交技術， 而檢測 RNA 的印跡雜交技術叫Northern，檢測蛋白的，太熟悉了叫 Western 。第二種檢測 DNA 甲基化的方法是 PCR 的衍生技術， PCR 是分子生物學的基礎技術， 從這個技術衍生出來的 DNA 甲基化檢測， 其群眾基礎就更好了， 是當前流行的方法。第一種技術叫 MS-PCR（methylation specific PCR）， 簡稱 MSP——甲基化特異性 PCR。原理是 DNA經過亞硫酸氫鈉處理后， 非甲基化的胞嘧啶會轉變成尿嘧啶而甲基化的保持不變， 這樣設計兩對特異性的引物去擴增甲基化和非甲基化的 DNA 結果就出來了。類似的技術還有 BSP（Bisulfite sequencing PCR）：同樣用亞硫酸氫鹽處理 DNA， 設計引物進行 PCR， 在擴增過程中尿嘧啶會被識別為胸腺嘧啶， DNA 序列就改變了， 對 PCR 產物進行測序就可以獲得結果。其他基于 PCR 衍生還有高分辨溶解曲線技術（High Resolution Melting， HRM）， 檢測精度也很高；還可以用帶熒光標記的 Taqman 探針做 qPCR， 有試劑盒可以直接用。這些檢測技術針對的是已知的 DNA 甲基化位點；大規模的 DNA 甲基化位點篩選也有， 有 DNA甲基化組學（Methylome）， 用基因芯片和二代測序都可以做篩選， 跟篩基因差不多。我們比較少直接篩甲基化差異， 更多的情況是已有一個主變量， 表型做完， 上游找機制的時候考慮 DNA 甲基化， 這種策略是不需要做高通量篩選的。具體怎么做？從啟動子區找 CpG 島的過程很簡單， CpG 島是一個序列特性， 不涉及復雜的生信算法， 用來搜索 CpG 島的軟件有：CpG Analyzer、 CpGcluster、 CpGFinder、 CpG Island Explorer、 CpG Island Searcher 等，另外甲基化引物設計軟件 Methyl Primer Express 以及 MethPrimer 也有相應的 CpG 島搜索功能。找到了這些 CpG 島的位點， 接下來用特異性甲基化檢測方法比如 MSP， BSP 檢測分析就好了。在預測分析這一步， 甲基化要比轉錄因子簡單得多， 甚至檢索啟動子序列的數據庫也能提供相關的 CpG 島甲基化位點信息。我們知道染色質是由核小體組成的， 核小體包含 4 種組蛋白 H3、 H4、 H2A、 H2B， 組裝成 8 聚體的復合物。四種組蛋白內部結合非常緊密， 但 N 端會伸向外側， 形成各種組蛋白修飾酶的作用位點。組蛋白修飾主要有兩個作用：影響染色質結構從而調控轉錄， 或者作為信號招募轉錄因子和輔助的調控蛋白。在所有的修飾里， 甲基化是目前研究比較清楚的一種組蛋白修飾方式， 是由組蛋白甲基化轉移酶（Histone methylation transferase， HMT） 催化， 可以發生在賴氨酸和精氨酸兩種氨基酸上。賴氨酸可以 1， 2， 3 甲基化， 也就是分別添加 1 個， 2 個， 3 個甲基；而精氨酸可以 1， 2甲基化。在文獻里看到組蛋白甲基化會覺得有點煩， 位點特別多：H3K4、 H3K9、 H3K27等讓你無所適從。我跟大家講講規律， 這些組蛋白甲基化位點前面 H3、 H4 是組成核小體的組蛋白名稱， 后面的 K 是賴氨酸縮寫， 而 R 是精氨酸縮寫， 氨基酸后面的數字就是第幾個賴氨酸或精氨酸的序列位置。有時候 H3K4 后面還會跟 me1， 2， 3， 這是 1 甲基化， 2 甲基化和 3 甲基化， 加一個兩個三個甲基的區別。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的access2013数据库实验笔记_医学科研实验基础知识笔记（十）：甲基化的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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