目前用于轉錄組數據獲得和分析的方法主要有基于雜交技術的芯片技術,基于序列分析的基因表達系列分析(SAGE)和大規模平行信號測序系統(MPSS),以及最新提出的RNA-Seq技術等。基因芯片是開發最早也是目前應用較廣的高通量轉錄組檢測技術。該技術成本適中,數據分析軟件較多,整個方法較為成熟,然而基于雜交技術的微陣列技術只限用于已知序列,無法檢測新的RNA;而且雜交技術靈敏度有限,難以檢測低豐度的目標(需要更多的樣品量)和重復序列;也很難檢測出融合基因轉錄、多順反子轉錄等異常轉錄產物。與芯片不同,SAGE不需任何基因序列的信息,能夠全局性地檢測所有基因的表達水平,除了具有顯示基因差異表達譜的作用外,還對那些未知基因特別是那些低拷貝基因的發現起到了巨大的推動作用。MPSS技術是對SAGE技術的改進,簡化了測序過程,提高了精度,但二者都是基于昂貴的Sanger測序,需要大量的測序工作,技術難度較大,而且涉及酶切、PCR擴增、克隆等可能會產生堿基偏向性的操作步驟,因而限制了其推廣。相比之下,RNA-Seq技術具有諸多獨特優勢。(1)數字化信號：直接測定每個轉錄本片段序列,單核苷酸分辨率的精確度,可以檢測單個堿基差異、基因家族中相似基因以及可變剪接造成的不同轉錄本的表達,同時不存在傳統微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題,能覆蓋信號超高的動態變化范圍。(2)高靈敏度：能夠檢測到細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本。(3)任意物種的全基因組分析：無需預先設計特異性探針,因此無需了解物種基因信息,能夠直接對任何物種進行轉錄組分析,這對非模式生物的研究尤為重要,例如Wang等、Xiang等和Vera等利用RNA-Seq技術分別對白粉虱、海鱸魚和蝴蝶轉錄組進行了研究。同時能夠檢測未知基因,發現新的轉錄本,并精確地識別可變剪切位點及cSNP,UTR區域。(4)更廣的檢測范圍：高于6個數量級的動態檢測范圍,能夠同時鑒定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本;而芯片對過低或過高表達的基因缺乏敏感性,因而動態檢測范圍小。此外,RNA-Seq重復性好,無需技術重復,而且起始樣品比芯片技術要少得多,尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析,如癌癥干細胞。

總結

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