1：避免交叉污染——勤換槍頭和高壓槍頭和PCR管。2：引物設(shè)計(jì)要正確，選擇可靠的生物公司合成引物，如果公司不好，給的引物會(huì)不出結(jié)果3：DNA提取要成功。4：引物和模板和體系所加的比例要合適，模板過量會(huì)抑制體系的反應(yīng)。5：跑膠時(shí)注意區(qū)分開EB污染區(qū)和清潔區(qū)。6：吸取試劑前不必每次都混勻，離心是為了把粘在壁上和蓋上的試劑離下來(lái)。不離也沒關(guān)系，可以直接用槍頭吸。但是配制的時(shí)候需要充分混勻，比如溶解引物，需要先混勻再分裝。7：DNA提取之后最好4度過夜之后再做PCR，這有利于DNA的充分溶解。大家再來(lái)補(bǔ)充

1、PCR實(shí)驗(yàn)一定要保管好試劑，防止交叉污染，尤其是ddH2O2的交叉使用，極易引起污染。2、NA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染。3、PCR在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作前后紫外燈消毒。4、超凈臺(tái)內(nèi)設(shè)內(nèi)供PCR用微量離心機(jī)、一次性手套、整套移液器和其它必須品；移液品用一次性吸頭和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。5、PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換。成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。6、試劑管用前先瞬時(shí)離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機(jī)會(huì)。7、最后加模板DNA（包括在石蠟油后），馬上蓋好，混勻，瞬時(shí)離心（10s），使水相與有機(jī)相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板DNA后應(yīng)更換手套。8、引物稀釋時(shí)，要首先瞬時(shí)離心，以避免粉末狀引物在開蓋時(shí)彈出管外。9、實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

要注意的問題太多了，首先，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，結(jié)構(gòu)要好，長(zhǎng)度應(yīng)在20bp左右，避免引物間形成引物二聚體。兩條引物的退火溫度盡量保持一致，最好是在55度左右。其次，使用的DNA模板量是比較關(guān)鍵的，應(yīng)使用純度較高，基因組較完全，沒有產(chǎn)生斷鏈的基因組DNA。然后是PCR體系中各個(gè)試劑的使用，比如說(shuō)酶的純度，活性，并且要注意酶量一定要適中，各DNTP的量要保持一致。最后是PCR程序的設(shè)置。如果怕一開始就使用一個(gè)固定的退火溫度擴(kuò)增不出來(lái)，可以先小批量得試驗(yàn)溫度梯度，或者用touchdown程序，即先設(shè)置一個(gè)較高的退火溫度，這樣引物的特異性結(jié)合會(huì)比較好，然后每個(gè)循環(huán)的退火溫度都比上個(gè)循環(huán)低0.5度或1度，最終停留在某一個(gè)較合適的溫度完成整個(gè)程序。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的在PCR操作过程中应注意哪些？的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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