師姐嘔心瀝血整理的 qRT-PCR 注意事項

關鍵詞：?qRT-PCR　注意事項2017-07-17 10:17?來源：生物學霸?點擊次數：1257

大家都在說 qRT-PCR 實驗原理、引物設計、結果解讀等，而我覺得我應該和大家分享一下 qRT-PCR 的實驗操作事項。雖小，但是關乎結果。

在做 qRT-PCR 之前，我們需要對自己的 RNA 以及操作方法有清楚的了解，畢竟我們的努力是希望得到結果的，而不是簡單的練練手。所以在做 qRT-PCR 之前，我們需要確定以下問題（部分內容僅適用于 SYBR）。

你確定你的 RNA 沒有降解嗎？

NanoDrop 2000 只能檢測 RNA 的濃度以及純度，而對于 RNA 的完整性是沒法檢測的。

RNA（RNA Intesity Number）值可以反映 RNA 的完整性，通過 Agilent 2100 Bioanalyzer system 來檢測。

圖. 不同 RNA 樣本的 RIN 值示意圖（真核生物）

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但是實驗室一般不會有 Agilent 2100 Bioanalyzer，在這種情況下，我們可以通過甲醛膠檢測，但是對 RNA 總量的要求高，那么最快速的方法就是用普通的凝膠電泳。要求在 nuclease-free 的環境下，所以需要將電泳槽、溶膠瓶、凝膠托槽以及梳子用 DEPC 水沖洗干凈。瓊脂糖也是 nuclease-free（只要是新開封的就行），Loading Buffer 盡可能是新開封的，配置 1.2% 的凝膠。

注意，凝膠一定要保證溶解完全，要不然會導致條帶不均一，如圖中樣品 9。電壓太高或者跑太長時間會產熱，導致 RNA 降解，所以要合理控制電壓和時間。此外，跑膠也可以進一步確定樣品中是否有 DNA 的殘留，觀測點膠孔是否有大量滯留的條帶。

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圖. 凝膠電泳檢測 RNA

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你確定你的 cDNA 的濃度嗎？

實驗室大師兄的經驗是每次反轉得到的 20 ul 體系的 cDNA 直接稀釋 20X，而博后師姐是按照 10X 稀釋，我一般是看情況而定。因為每個人提的 RNA 質量不同，反轉的水平也分高低，再說反轉的技術也未必穩定。

所以在每次拿到反轉的 cDNA 后，我首先會稀釋 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循環數一般為 25 cycle，鑒定一下具體濃度，再決定最后的稀釋倍數。

你確定你的引物好用嗎？

可以通過 qRT-PCR 的溶解曲線，但是呢，這個還是要耗錢的。對于沒有很多錢的實驗室來說，在拿到很多引物的時候，可以通過普通的 RT-PCR 看看是否是單一條帶，鑒定一下引物的特異性。如果實驗室不差錢，則可以通過溶解曲線對所有的引物的特異性做一次鑒定。

你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎？

如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器，那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因為不兼容的 PCR 板會導致結果偏差。因為我的師姐就真的碰到過這種情況。

你確定你的實驗條件合適嗎？

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SYBR 要避免強光照射，所以在加 SYBR 試劑的時候盡量關掉頭頂的照明燈，只需借助微光完成就可以。

SYBR 放置 4 ℃ 保存，使用時輕輕上下顛倒混勻即可，避免泡沫產生，切忌用力渦旋。

有些小師妹怕自己加樣搞混，喜歡在 PCR 板上劃出標志，這樣做是不對的。因為你的標記極有可能影響到熒光信號的采集，所以一般我會建議師妹采用實驗記錄本協助記憶，如下所示。

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圖.qRT-PCR 加樣圖

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你確定你的操作正確嗎？

一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情說三遍。

為了減少 SYBR 在光下的曝光，個人喜歡先加入模板， 如下圖。根據經驗，少量模板的加入，容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差，我一般會將樣本再稀釋一倍，加樣的時候多加一倍，減少 H2O2?的加入量。

圖.qRT-PCR 加樣示意圖

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然后配置 qRT-PCR 體系，如下。

圖.qRT-PCR 體系配制圖

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注：配置過程需在冰上完成。

加好樣品后，貼好透明封板膜。盡量不要用手碰透明封板膜的表面，從膜兩邊空余處操作就行。因為手印也有可能可能影響到熒光信號的采集。然后就是用離心機低速迅速離心 10 S，防止樣本掛壁。

好了，基本的操作部分以及注意事項就這么多，希望能幫到大家。

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轉載于:https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9880122.html

總結

以上是生活随笔為你收集整理的qRT-PCR 注意事项的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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