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编程问答

ISME：华中农大李霞组发现大豆根际微生物组变化与根瘤菌共生效率的关系

發布時間：2023/12/8 编程问答 38 豆豆

生活随笔收集整理的這篇文章主要介紹了 ISME：华中农大李霞组发现大豆根际微生物组变化与根瘤菌共生效率的关系小編覺得挺不錯的,現在分享給大家,幫大家做個參考.

文章目錄

大豆根際微生物群落的變化及其與根瘤菌共生效率的關系
- 寫在前面
- 摘要
- 背景
- 結果
- - 不同類型土壤中大豆根際區微生物組的組成和多樣性
  - 圖 1 三種類型土壤中大豆根際區微生物組的α和β多樣性
  - 不同根際取樣部位的微生物共現和相互作用網絡
  - 圖 2 不同隔間區域中的微生物相互作用網絡
  - 大豆根瘤中根瘤菌的組成取決于土壤條件
  - 圖 3 土壤處理與根際和根瘤中的根瘤菌組成的關系
  - 根際微生物組與根瘤菌的結瘤有關
  - 圖 4 根際微生物群落結構與中華根瘤菌和慢生根瘤菌的結瘤有關
  - 在體外芽孢桿菌對根瘤菌生長的不同作用
  - 圖 5 芽孢桿菌對根瘤菌生長和結瘤的影響
  - 芽孢桿菌可緩解鹽堿條件對溫室中CCBAU45436結瘤表型的影響
  - 芽孢桿菌影響中華根瘤菌在根瘤中的定殖效率
  - 圖 6 芽孢桿菌對根瘤中根瘤菌定殖的影響
- 討論
- 材料與方法
- - 土壤類型和根瘤菌
  - 溫室實驗
  - 16S rRNA基因樣品的制備，測序和分析
  - 微生物的篩選與鑒定
  - 互作試驗
  - 結瘤試驗
  - 統計分析
- Reference
- 通訊作者簡介
- 猜你喜歡
- 寫在后面

大豆根際微生物群落的變化及其與根瘤菌共生效率的關系

Variation in rhizosphere microbial communities and its association with the symbiotic efficiency of rhizobia in soybean

The ISME Journal [IF:9.493]

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-020-0648-9

發表日期：2020-04-27

第一作者：Qin Han¹

通訊作者：Yang Bai(白洋)(ybai@genetics.ac.cn)², Wenfeng Chen(chenwf@cau.edu.cn)³, Xia Li(李霞)(xli@mail.hzau.edu.cn)¹

合作作者：Qun Ma, Yong Chen, Bing Tian, Lanxi Xu

主要單位：

¹華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, No. 1 Shizishan Road, Hongshan District, Wuhan 430070 Hubei,
China)

²中國科學院遺傳與發育生物學研究所植物基因組學國家重點實驗室(State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, The Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

²中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室(State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences and Rhizobium Research Center, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

寫在前面

關鍵字：中華根瘤菌，慢生根瘤菌，芽孢桿菌，根際微生物組，共生效率，鹽堿條件

點評：大豆根際具有特定的微生物群落，但是尚未對這些微生物是否影響根瘤菌結瘤進行深入研究，該研究報道芽孢桿菌和根瘤菌之間相互作用關系以及芽孢桿菌對脅迫下根瘤菌-豆類共生結瘤的影響的研究。為了了解大豆植物、根瘤菌和土著微生物群之間的相互作用，作者研究了三種土壤類型(pH不同)中根際區域微生物群的組成和網絡關系，鑒定了與根瘤菌結瘤相關的微生物，分離了候選菌株，并最終探討了它們在根瘤結瘤中的作用。本研究的發現為土著微生物群在根瘤菌適應其環境和調節根瘤菌共生效率中的作用提供了第一個證據。總而言之，本研究發現表明，根際微生物群在根瘤菌-大豆共生和植物適應脅迫環境中具有重要的調節作用。

摘要

根瘤菌-豆類共生是植物-微生物共生的一種重要類型；但是，這種關聯的建立很復雜，并可能受到許多因素的影響。大豆根際具有特定的微生物群落，但是尚未對這些微生物是否影響根瘤菌結瘤進行深入研究。在這里，我們分析了三種土壤類型中大豆根際區域微生物群的組成和相互關系。首先，我們發現在不同土壤中的大豆根際群落組成存在顯著差異，并檢查了根瘤菌與其他根際細菌之間的聯系網絡。其次，我們發現一些根際微生物與根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的組成有關。我們從堿性土壤中培養了278個候選芽孢桿菌分離株。最后，交互作用和結瘤試驗表明蠟狀芽孢桿菌組分別特異性地促進和抑制了中華根瘤菌和慢生根瘤菌的生長，并緩解了鹽堿條件對中華根瘤菌的結瘤及其在瘤中定殖的影響。我們的發現證明了細菌菌群在塑造大豆根瘤菌-宿主相互作用中的關鍵作用，并為通過使用合成細菌群落提高這種共生體系的共生效率提供了框架。

背景

氮是所有生物的重要元素。它是通過固氮從二氮分子(N₂)中提取的，氮氣占地球大氣的78％。因此，固氮對于生命至關重要。固氮主要通過固氮細菌和古細菌在土壤中進行。在固氮細菌中，根瘤菌可作為腐生菌生活在土壤中，也可作為共生菌生活在其寄主豆科植物的根瘤中。在這些根瘤中，根瘤菌固定了大氣中的氮以供宿主使用，而宿主則通過光合作用為根瘤菌提供碳。根瘤菌和豆科植物之間的這種共生是植物與微生物共生的一個極好的例子，不僅對豆科植物(例如大豆，鷹嘴豆，豌豆，普通豆和苜蓿)有益，而且對全球氮循環也有益。

根瘤菌-豆類共生的基礎是一個復雜的過程，包括多個階段，包括豆科植物根的根瘤菌侵染，根瘤發育，根瘤功能和根瘤衰老。雖然根瘤菌與豆科植物的相互作用已被廣泛認識，但這種互惠共生關系具有高度的特異性和廣泛的多樣性。例如，豆科根瘤菌 bv. trifolii只能感染三葉草物種(Trifolium spp.)，而Sinorhizobium fredii NGR234表現出廣泛的宿主范圍，可以感染112個豆科屬。根瘤菌對豆科宿主根細胞的選擇性識別和侵染是成功建立共生的前提。對于給定的宿主，根瘤菌的成功侵染不僅取決于不同根瘤菌物種的競爭能力，還取決于根瘤菌應對各種波動環境因素(包括土壤特性和pH值)的能力。

在大豆中，中華根瘤菌(Ensifer)和慢生根瘤菌是兩個主要的微共生類群，它們的結瘤能力不同。值得注意的是，這些根瘤菌在具有不同pH值的土壤中相互競爭。在酸性土壤中，大豆cv. Williams根瘤菌中的慢生根瘤菌菌株如 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110占主導地位；相反地，在堿性土壤中，大豆根瘤中以中華根瘤菌菌株為主。有人提出，這些根瘤菌對不同pH值土壤的適應性是由慢生根瘤菌和中華根瘤菌介導的大豆根瘤的生物地理模式的基礎。的確，中華根瘤菌種類在堿性鹽漬土中占主導地位，而慢生根瘤菌在中性至酸性土壤中占主導地位。

土壤中還含有數十億種的微生物，包括細菌和真菌。根瘤菌可能與其潛在宿主豆科植物的根際或土壤中的這些微生物競爭，從而建立共生關系。據報道，豆科植物，例如 L. japonicum, M. truncatula和大豆，在根際或根部的細菌裝配的建立中起著至關重要的作用，而根瘤菌和豆類之間的共生直接影響著這兩個區域中微生物的結構。構成常見結瘤信號通路或介導類黃酮和硝酸鹽改變的基因(例如，Nod因子受體5，Nodule起始和Lotus組氨酸激酶1)功能的喪失會影響豆科植物根瘤菌的侵染，從而重塑根際微生物群落。植物與各種微生物建立密切的聯系，形成復雜的群落，這些群落在宿主植物和環境之間會有所不同，這種平衡的改變可能會影響宿主的生長或導致疾病。大量證據表明，與根相關的微生物組可以影響植物與病原體相互作用的結果。因此，我們推測，根瘤菌-豆類共生體也可能受到生活在土壤中或棲息在植物生態位中的共生微生物的影響。此外，在大豆中，某些特定的官能團在根際中比在土體土壤中更具代表性，并涉及包括氮，鐵，磷和鉀的代謝在內的功能，但尚未確定它們是否影響宿主-根瘤菌的相互作用。

在這項研究中，為了了解大豆植物，根瘤菌和當地微生物群之間的相互作用，我們研究了三種土壤類型中根際區域微生物群的組成和網絡關系。此外，我們鑒定了與根瘤菌結瘤相關的微生物，分離了候選菌株，并最終探討了它們在根瘤結瘤中的作用。我們的發現為土著微生物群在根瘤菌適應其環境和調節根瘤菌共生效率中的作用提供了第一個證據。

結果

不同類型土壤中大豆根際區微生物組的組成和多樣性

Composition and diversity of the soybean rhizocompartment microbiota in different types of soils

為了研究在不同土壤中生長的大豆微生物的組成和多樣性，我們從武漢(湖北省)，四平(黑龍江省)和欒城縣(河北省)三個主要大豆產區收集了三種不同類型的土壤，這些土壤的pH值分別為5.63(酸性)，7.2(中性)和8.23(堿性)。因此，我們按照Bulgarelli等人和Xiao等人的描述收集了根，根際，根瘤和土體土壤樣品。通過PCR擴增16S rRNA基因的V5-V7區，并在Illumina MiSeq平臺上測序。總共從48個樣本中獲得了1,797,926個高質量的非嵌合序列，每個樣本的中值序列值為37,457(范圍為30,032-44,608)。補充Fig. S2a中顯示了基于OTU編號的分隔樣品的稀疏曲線。測序數據被稀疏到在單個樣品中觀察到的最低數量的讀長，并鑒定出3107個細菌OTU。補充表S5中顯示了高通量測序結果的一般特征以及所有級別的分類單元編號。Good’s coverage對于觀測到的OTU的覆蓋率為98.65±0.08％(mean?±?s.e.m.)，除了土體土壤和根際樣品之間的差異外，其他隔室樣品之間的Chao1指數值存在顯著差異。

對于土體土壤，細菌群落組成在不同土壤中差異很大。酸性土壤中主要微生物菌群的相對豐度(包括酸桿菌門，變形菌門和綠彎菌門)顯著高于中性(Ne)或堿性(Al)土壤，而中性(Ne)和堿性(Al)土壤中放線菌門、厚壁菌門和芽孢桿菌比酸性(Ac)土壤中的豐富(FDR矯正P<0.05，Kruskal–Wallis H檢驗)。三種土壤中的變形菌門和放線菌門的差異在根際樣品中更大，但在根和根瘤樣品中沒有觀察到。在科水平上，還觀察到了不同土壤類型的根際取樣部位細菌組成的差異，并且該趨勢與門水平上的趨勢一致。在前十個科中，土體土壤樣品中的所有物種，根際樣品中的六個物種，根樣品中的五個物種以及根瘤樣品中的只有兩個物種顯著不同，分別屬于根瘤菌科和慢生根瘤菌科。阿爾法多樣性分析(Shannon指數)表明，在三種土壤中，大豆根和根瘤微生物群落之間的差異在被測土壤中不如在根際或土體土壤樣品中明顯(圖.1a)。Bray–Curtis距離的PCoA(β多樣性)表明，三種土壤中的土體土壤(圓形)，根際(正方形)和根(三角形)微生物群表現出清晰的分離(圖.1b)。對于根瘤取樣部位，酸性(Ac)和中性(Ne)土壤樣品聚集在一起，但與堿性(Al)土壤樣品完全分開。基于Bray-Curtis和加權UniFrac距離的PERMANOVA證實，當在三種土壤中生長時，大豆三個根際取樣部位中的微生物群落都具有顯著差異(P<0.01)。

圖 1 三種類型土壤中大豆根際區微生物組的α和β多樣性

Alpha and beta-diversity of the soybean rhizocompartment microbiota in three types of soils

a 測量酸性土壤(Ac)，中性土壤(Ne)和堿性土壤(Al)中不同取樣部分微生物群落的α-多樣性(Shannon指數)。通過配對的Wilcoxon秩和檢驗進行統計分析，并以星號表示顯著性，其中* P <0.05。數據以中值±SDs(n=4)表示。

b 基于Bray–Curtis距離的PCoA表明，土壤類型是根際和根部細菌群落變異的主要來源。N=108。通過土壤類型的聚類顯著性由Adonis確定(Pr(>F)= 0.001)。每個點對應于一個按土壤類型著色的不同樣本，每個取樣部位用不同的形狀表示。

不同根際取樣部位的微生物共現和相互作用網絡

Microbial cooccurrence and interaction networks in the different rhizocompartments

不同微生物菌株之間的相互作用是種群結構和動力學的主要驅動因素之一，因為微生物可以相互合作或彼此排斥。因此，我們接下來使用Networkx軟件分析不同隔間區域中的交互網絡。根據屬在三種不同土壤類型的樣本中的發生模式，計算屬之間的Spearman相關值。我們的結果顯示，根際區隔微生物群內的節點連接性很高。在屬水平前30種細菌的分析中，土體土壤中有202種相關性(圖2a)，根際有184種相關性(圖2b)，根部有90種相關性(圖2c)，根瘤樣本中有185個相關性(圖2d)。這些結果表明，與土體土壤相比，根際和根部的相互作用網絡相對簡單。在根瘤中，細菌之間的相關性增加，而微生物網絡的復雜性下降。除了慢生根瘤菌與中華根瘤菌(?0.847637)，Rhodococcus (?0.623598)，和 unclassified_f__Alcaligenaceae (?0.770069)呈負相關外，連通性表明所有其他屬均呈正相關，這表明這些類群可以與大豆根瘤中的根瘤菌共現，并且不會彼此排斥。此外，我們發現在根際樣品中也觀察到了慢生根瘤菌和中華根瘤菌之間的負相關性(-0.70403)。此外，慢生根瘤菌和中華根瘤菌分別與另外14個和13個不同的根際屬(正和負)相關(圖2b)，這可能影響這兩種類型的根瘤菌的結瘤。

圖 2 不同隔間區域中的微生物相互作用網絡

Microbial interaction networks in the different compartments

土體土壤(a)，根際(b)，根(c)和根瘤(d)中屬水平(前30位)的優勢菌群相互作用網絡。節點的大小表示OTU的豐度，不同的顏色表示在門水平的相應物種分類分配。邊顏色表示正(紅色)和負(綠色)相關。邊寬度表示相關值。僅顯著相關的(r>0.6；P<0.05)被顯示出來。

大豆根瘤中根瘤菌的組成取決于土壤條件

The composition of rhizobia in soybean nodules is soil condition-dependent

在天然酸性或中性土壤的根瘤群落中(圖3a–I)，慢生根瘤菌是最豐富的菌屬，約占總豐度的99.97％。相比之下，中華根瘤菌在來自堿性土壤的根瘤中占優勢(98.56％)，而在來自酸性土壤(0.081％)或中性土壤的根瘤中的卻占極少比例(0.007％)(圖.3b–I)。為了進一步探討土壤因素對根瘤中根瘤菌組成的影響，我們對種植的土壤進行了人工干預。首先，我們通過添加石灰(pH 8.2)來改變酸性或中性土壤的pH(圖3a–II)；第二，我們將酸性或中性土壤與堿性土壤(1：1；w/w)混合(圖3a–III)；再者，在種植植物之前，我們將土壤在80°C條件下加熱20分鐘(圖3a–IV)。讓滅菌的大豆種子在這些土壤中生長28天，并如上所述收集根際土壤(28個樣品)和根瘤(28個樣品)。這56個樣品的擴增和測序產生了2,703,009個高質量序列(每個樣本平均48,268且范圍為30,585–95,823個序列)。補充圖S7顯示了基于OTU數量的來自兩個取樣區域樣品的稀釋曲線。使用與上述相同的標準將序列聚類到OTU中，產生2830個微生物OTU，兩個取樣部位的Chao1和Shannon指數顯著不同(FDR矯正P <0.001，Wilcoxon秩和檢驗)。

圖 3 土壤處理與根際和根瘤中的根瘤菌組成的關系

Relationship between soil treatment and composition of rhizobia in the rhizosphere and nodules

a 土壤處理的示意圖。酸性土壤 (Ac)，中性土壤(Ne)，堿性土壤(Al)，酸性土壤加石灰(Ac8)，中性土壤加石灰(Ne8)，加熱的酸性土壤(HAc)，中性土壤(HNe)，堿性土壤(HAl)，用50％(w/w)酸性土壤(Ac/Al)或中性土壤(Ne/Al)修飾的堿性土壤。

b 圖a所示土壤中種植的植物根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的相對豐度。I，II，III和IV分別代表普通土壤，pH值變化，混合土壤和熱處理的土壤。紫色代表慢生根瘤菌。藍色代表中華根瘤菌。星號表明，中華根瘤菌的相對豐度要高于慢生根瘤菌。

改變酸性或中性土壤的pH值以創造堿性條件后，根瘤中中華根瘤菌的豐度沒有增加(圖.3b–II)。這表明，除了土壤的pH值外，土壤中的其他因素也可能影響根瘤中根瘤菌的組成。當大豆在酸性堿性混合土壤(pH 6.93)中生長時，中華根瘤菌的相對根瘤豐度(86.56％)超過了慢性根瘤菌，而在中性堿性混合土壤(pH 7.71)中，中華根瘤菌的根瘤豐度卻沒有顯著變化(圖.3b–III)。進一步的熱處理實驗表明，在熱處理的中性土壤中，根瘤中中華根瘤菌的相對豐度顯著增加(54.64％)。但是，在經過加熱處理的酸性土壤中生長的大豆植株中并未發現這種變化(圖. 3b–IV)。這些結果共同表明，種植土壤對根瘤中根瘤菌組成的影響是復雜的，并不僅僅取決于土壤pH。

根際微生物組與根瘤菌的結瘤有關

Rhizosphere microbiomes were associated with nodulation of rhizobia

為了確定根瘤中根瘤菌組成的變化是否與根際細菌有關，我們分析了十個根際樣品的微生物群落組成，并進行了聚類分析。熱圖分析的層次聚類結果根據優勢門將十個根際樣品分為三個主要簇，這三個簇在門上具有不同的細菌組合(圖. 4a)。這些聚類通過基于Bray–Curtis距離和PERMANOVA的PCoA確認(P <0.05)，并且在十種土壤處理中觀察到明顯的聚類。主變異軸(解釋總變異的37.9%)將聚類3(Ac, Ac8, and HAc)和聚類2(HNe and HAl)同聚類1(Ne, Ne8, Al, Ac/Al, Ne/Al, HNe, and HAl)分開，而次變異軸(解釋總變異量的20.6%)將聚類2與聚類3分開(圖. 4b)。

圖 4 根際微生物群落結構與中華根瘤菌和慢生根瘤菌的結瘤有關

The rhizosphere microbial community structure was associated with the nodulation of Bradyrhizobium and Sinorhizobium

a門水平不同根際樣品的細菌微生物的組成和聚類。

b土壤中生長的大豆幼苗的根際微生物組基于Bray–Curtis距離的PCoA分析如圖3a所示；n=40。聚類的顯著性由Adonis(Pr(>F)=0.001)確定。酸性土壤(Ac)，中性土壤(Ne)，堿性土壤(Al)，酸性土壤加石灰(Ac8)和中性土壤加石灰(Ne8)，用50％(w/w)酸性土壤(Ac/Al)或中性土壤(Ne/Al)修飾的堿性土壤和加熱的酸性土壤(HAc)，中性土壤(HNe)，堿性土壤(HAl)。

c線性判別分析(LDA)結合效應尺度的測量，確定了b中數據的顯著豐富性。富集在I組(紫色)和II組(藍色)的分類群分別用LDA分數表示。僅顯示LDA值大于3.5(P <0.05)的分類群。

接下來，我們根據根瘤中根瘤菌的組成 (圖. 3b)將這10種處理分為I組 (Al, Ac/Al, HNe, 和
HAl)和II組(Ne, Ne8, Ne/Al, Ac, HAc, and Ac8)，并利用線性判別分析效果尺度(LEfSe)算法。結果表明，八個和五個科(LDA log得分閾值>3.5和P<0.05)最有可能分別解釋了I組和II組之間的差異。在第一組中，Comamonadaceae的LDA得分最高(5.16)，其次是Pseudomonadaceae (4.89)， Alicyclobacillaceae (4.09)， Paenibacillaceae (4.7)，Rhizobiaceae (3.99)，Bacillaceae (3.98)，和Microbacteriaceae (3.73)，其被確定為I組的主要關鍵科，可能與中華根瘤菌的結瘤有關。相比之下，第二組中的指示細菌科聚集在Micrococcaceae (4.29)，Intrasporangiaceae (3.90)，norank_o__Gaiellales (3.77)，norank_o__SC_I_84 (3.68)，and norank_p__Saccharibacteria (3.52)，這可能與慢生根瘤菌的結瘤有關。

在體外芽孢桿菌對根瘤菌生長的不同作用

Differential effects of Bacillus on the growth of rhizobia in vitro

在上述指示的科中，Bacillaceae是植物-微生物相互作用中的有益微生物，已在許多植物根際中被檢測到，并且因其具有植物抗病性和促進植物生長的特性而聞名。Bacillaceae(占第一組OTUs的4.30%)在堿性根際樣品中含量很高，而Bacillus與根際樣品(圖.2b)中的中華根瘤菌呈顯著正相關(r=0.714537)，這一事實促使我們探索Bacillus在根瘤菌結瘤中的可能機制。為此，我們從經熱處理的堿性土壤中分離出候選Bacillus菌株。首先，選擇了278個候選Bacillus分離株，并在YMA培養基(0.7％瓊脂)上檢查了它們與S. fredii CCBAU45436的相互作用。結果表明，一組具有相似形態的分離株(?12.6％)顯著促進了S. fredii CCBAU45436的生長。其余測試菌株對CCBAU45436的生長幾乎沒有影響。通過基于16S rRNA的方法，三個具有明顯促進作用的代表性分離株(B-9，B-11和B-13)被鑒定為蠟狀芽孢桿菌組(屬于OTU1511)。為了在物種水平上進一步鑒定這些菌株，我們通過Illumina Hiseq平臺進行了基因組測序。根據它們的平均核苷酸同一性(ANI)值，將這三個菌株重新分類為Bacillus albus B-9(95.61% ANI to B. albus N35–10–2)，B. cereus B-11(97.98% ANI to B. cereus ATCC 14579)和B. albus B-13(98.26% ANI to B. albus N35–10–2)。

當將CCBAU45436和3個Bacillus菌株在YMA培養基上以不同距離(0.6或1.2 cm)共培養4天時，S. fredii CCBAU45436的菌落直徑(1.14 cm)(距Bacillus)在0.6 cm處明顯大于距離1.2 cm的菌落(0.91 cm)(圖5a，n = 12，P <0.0001，非參數Mann-Whitney檢驗)。更有趣的是，當B. diazoefficiens USDA110和Bacillus在YMA培養基上共培養時，與Bacillus相鄰的USDA110的生長受到明顯抑制(圖5b)，變成橢圓形(圖5c)。未觀察到Pseudomonas菌株(也從堿性土壤中分離)對CCBAU45436有明顯的生長促進作用，對USDA110有明顯的抑制作用。此外，Bacillus還刺激了γ射線滅菌的堿性土壤中的S. fredii CCBAU45436的生長，但抑制了B. diazoefficiens USDA110的生長。總體而言，這些結果表明*B. cereus***組可以分別特異性地促進和抑制CCBAU45436和USDA110的生長，再次表明***Bacillus*屬與根瘤菌相互作用。

圖 5 芽孢桿菌對根瘤菌生長和結瘤的影響

Effect of Bacillus on the growth and nodulation of rhizobia

a 在YMA平板上，將芽孢桿菌菌落接種在S. fredii CCBAU45436菌落旁邊，距離為1.2 cm或0.6 cm。

b 將芽孢桿菌菌落接種在B. diazoefficiens USDA110菌落旁邊，距離為1.2 cm或0.6 cm。

c B. diazoefficiens USDA110的反向菌落接種在 a 中的Bacillus B-9附近。結果代表具有相似結果的三個重復樣品之一。比例尺代表2毫米。

d 在對照條件下，用水或芽孢桿菌處理的CCBAU45436或USDA110接種植物的根瘤數。

e 在鹽堿條件下用H₂O或芽孢桿菌處理過的CCBAU45436或USDA110接種植物的根瘤數(25 mM NaHCO₃ +75 mM NaCl)；實驗重復兩次。統計學分析通過Mann-Whitney非參數檢驗進行，顯著性用星號表示，其中*表示P<0.05。數據表示為中值±SD(n＝4)。

芽孢桿菌可緩解鹽堿條件對溫室中CCBAU45436結瘤表型的影響

Bacillus alleviates the effect of saline–alkali conditions on the nodulation phenotype of CCBAU45436 in the greenhouse

接下來，我們研究了芽孢桿菌對溫室中CCBAU45436和USDA110結瘤能力的影響，并添加不同濃度的過碳酸鈉和氯化鈉到蛭石上，以模擬鹽堿條件。在對照條件下(pH 7)，USDA110接種的大豆的根瘤數要多于CCBAU45436接種的植物，但差異不顯著。隨著pH(碳酸氫根離子濃度)的增加，接種根瘤菌的兩種植物中的根瘤數均增加，但接種CCBAU45436的植物中的根瘤數比對照條件下的增加更為明顯。pH值為8(25 mM NaHCO₃ + 75 mM NaCl)時，最大的結瘤數(165)與較小的尺寸和葉片萎黃有關。對于USDA110接種的植物，pH=8.5時(50mM NaHCO₃+50mM NaCl) ，結瘤數最多(128)，而且萎黃病的嚴重程度不及接種CCBAU45436的植物。

在pH 7(對照)條件下，芽孢桿菌處理不會顯著影響接種CCBAU45436或USDA110的植物的根瘤數(圖. 5d)；與之形成鮮明對比的是，芽孢桿菌處理(B-9和B-11)恢復了接種CCBAU45436的植株的根瘤表型(減少的根瘤數)，而芽孢桿菌在pH=8(25 mM NaHCO₃ + 75 mM NaCl)條件下不影響USDA110接種的植株的根瘤數或大小(圖. 5e)。
總之，這些結果表明CCBAU45436-大豆共生體比USDA110-大豆共生體對pH更敏感，并且芽孢桿菌可以減輕pH對CCBAU45436-大豆共生的抑制作用。

芽孢桿菌影響中華根瘤菌在根瘤中的定殖效率

Bacillus affects colonization efficiency of Sinorhizobium in nodules

為了進一步研究芽孢桿菌對大豆根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌定殖的作用，我們進行了根瘤菌混合接種實驗。在鹽堿溶液(pH 8)條件下，將三種慢生根瘤菌和三種中華根瘤菌菌株共接種到有或沒有芽孢桿菌的大豆植株上(圖. 6a)。中華根瘤菌和慢生根瘤菌分別對堿和酸條件有更強的抵抗力，這與以前的研究一致。接種后28天，根瘤中的中華根瘤菌或慢生根瘤菌的種群分別以mlr6601或nodC的基因拷貝表示，并使用屬特異性引物通過qPCR進行定量。使用CCBAU45436和USDA110基因組DNA的系列稀釋液獲得各自的標準曲線。同樣，在對照條件下，有無芽孢桿菌處理的根瘤中，中華根瘤菌或慢生根瘤菌(基因拷貝)的種群數量也沒有顯著差異(圖. 6b)。鹽堿處理后，根瘤中mlr6601(中華根瘤菌)的基因拷貝略有增加(0.003增加到3.617×10⁵)，但與芽孢桿菌共接種后，其顯著增加(增加到13.252×10⁵)(圖. 6b，c)。接種芽孢桿菌前后，nodC(慢生根瘤菌)的基因拷貝數也減少，但差異不顯著(圖. 6c)。此外，我們用特異引物（OPL-114F-lipo和OPL-114R-lipo）擴增了根瘤樣品中芽孢桿菌的標記基因，未檢測到條帶(數據未顯示)，表明接種的芽孢桿菌沒有進入根瘤。總之，這些結果表明，芽孢桿菌可能以依賴于堿性條件的方式間接地促進了中華根瘤菌在根瘤中的定殖。

圖 6 芽孢桿菌對根瘤中根瘤菌定殖的影響

Effect of Bacillus on the colonization of rhizobia in nodules

a 混合接種實驗的示意圖，顯示了種植，接種和定量檢測方法。將三天大的植物移植到對照或鹽堿處理的蛭石中，然后用混合的根瘤菌或含芽孢桿菌的混合根瘤菌接種。28天后，提取根瘤中的類細菌DNA，通過qPCR定量兩種根瘤菌的濃度，并重復兩次實驗。

b 在對照條件下，中華根瘤菌或慢生根瘤菌的種群數量。

c 在鹽堿條件下，中華根瘤菌或慢生根瘤菌的種群數量。Mix-R表示六株根瘤菌。用非參數Mann-Whitney檢驗分析了Mix-R和Mix-R+Bacillus處理的qPCR結果(n=4，ns不顯著；* P<0.05)。每個圖的柱狀圖表示中位數，并在適當的位置列出數值以便于清晰顯示。

討論

成功的共生體受根瘤菌及其豆類宿主的共同調節；此外，給定宿主中根瘤菌的結瘤率是可變的，并且受環境因素和共生根瘤菌的影響。一個眾所周知的例子是，在不同pH值的土壤種植的大豆中，中華根瘤菌和慢生根瘤菌的結瘤率存在很大差異；中華根瘤菌和慢生根瘤菌的pH耐受性差異可能解釋了這些根瘤菌的地理分布模式。比較基因組分析顯示，已知與堿鹽適應有關的屬特定基因可能有助于觀察到大豆中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的根瘤形成的生物地理模式。在這里，我們發現大豆根際微生物群，特別是蠟狀芽孢桿菌類，影響中華根瘤菌和慢生根瘤菌的生長，這可能影響這兩種根瘤菌的結瘤。

先前的研究表明，豆類具有核心的根際微生物組，其組成取決于宿主的基因型。我們發現，在三種土壤中生長的大豆植物在根際比根部具有更大的微生物多樣性(圖1a)，這與大豆和苜蓿的結果相似。這些結果表明，根部的微生物群落比起根際或土壤中的更能適應波動的生長環境，并且豆科植物在進化過程中獲得具有招募某些可能對其生長有益的微生物的能力。此外，我們發現根際室微生物，尤其在根際中存在明顯的相關性，包括根瘤菌與其他根際類群之間的相互作用(圖2b)，這與研究表明的在中國51個大豆田中的土體土壤和根際中的細菌子網絡受土壤pH值的影響最大相一致。

根瘤是根瘤菌生長空間的器官，是共生固氮的場所。先前的研究表明，根瘤內生菌的組成是植物物種特有的；在苜蓿中，中華根瘤菌是最主要的根瘤菌，而大豆根瘤中，中華瘤菌和慢生根瘤菌是最豐富的屬。我們發現在堿性土壤中中華根瘤菌是根瘤中的優勢種，而在中性和酸性土壤中慢生根瘤菌是根瘤中的優勢種(圖3b)。這些結果與以前的報道一致，后者表明大豆根瘤菌群落表現出巨大的生物地理類型，這是由當地的氣候和水生因素所塑造的(有效鐵和土壤pH)。此外，我們發現根瘤中的根瘤菌組成也可能受其他根際微生物群的影響，例如芽孢桿菌科，其可能與中華根瘤菌和慢生根瘤菌的根瘤定殖有關(圖.5a，b)。

芽孢桿菌科是眾所周知的有益根際和內生細菌，在大豆微生物群的非根際亞群落中占主導地位。據報道有數種芽孢桿菌菌株影響大豆結瘤，但尚不清楚芽孢桿菌在大豆結瘤中的作用。有趣的是，我們的數據顯示，從鹽堿土壤中分離的蠟狀芽孢桿菌組菌株能特異性促進CCBAU45436的生長，但會抑制USDA110的生長(圖. 5a，b)，并且我們推測芽孢桿菌也可能影響根瘤菌在土壤中的分布。通過用碳酸氫鈉和氯化鈉模擬鹽堿條件，我們發現隨著pH的增加，即使結瘤很小，但接種CCBAU45436的植物中的結瘤數也會增加，這也可能部分解釋了為什么中華根瘤菌在堿性土壤條件下占主導地位。同樣，在低磷條件下，某些根瘤菌也可以誘導更多和較小的根瘤，因為它們對壓力相對更敏感。在正常條件下，芽孢桿菌不會影響CCBAU45436或USDA110接種植物的根瘤數。然而，芽孢桿菌處理在鹽堿條件下恢復了CCBAU45436接種大豆植株的根瘤缺陷(主要是根瘤數)(圖5e)，并且也影響了中華根瘤菌在根瘤中的定殖(圖.6)。眾所周知，根相關的細菌可以減輕鹽分和堿度脅迫對植物的不利影響，因此這些根部相關的細菌可能有益于豆類中那些脅迫敏感性根瘤菌的結瘤。合作和競爭的微生物相互作用是在不同的隔間中驅動復雜的微生物組合以實現植物適應性的重要的選擇力。據我們所知，該研究是第一個報道芽孢桿菌和根瘤菌之間相互作用關系以及芽孢桿菌對脅迫下根瘤菌-豆類共生結瘤的影響的研究。這些相互作用是否能在根際發生，以及芽孢桿菌如何影響鹽堿條件下的根瘤表型和根瘤菌定殖仍不可知。進一步研究芽孢桿菌和根瘤菌之間的這種特殊相互作用，將有助于我們破譯芽孢桿菌在不同土壤條件下調節大豆根瘤中根瘤菌結瘤和定殖的分子機制。

總而言之，我們的發現表明，根際微生物群在根瘤菌-大豆共生和植物適應脅迫環境中具有重要的調節作用。這些發現為大豆結瘤根瘤菌在田間的分布提供了新的見解并且提供了脅迫條件下大豆或其他豆科植物促進根瘤菌形成根瘤的新方法。豆科植物的完整基因組及其微生物對應物應被視為是根瘤菌-豆科植物共生體的遺傳基礎和提高共生固氮效率的基因工程中的重要組成部分。

材料與方法

土壤類型和根瘤菌

Soil types and rhizobia

2016年秋季，從中國三個主要的大豆種植區收集了15 cm深度的實驗土壤：湖北武漢(30°48′30N，114°36′E)，河北省欒城縣(37°94′N，114°72′E);及黑龍江省四平市(43°51′N，124°81′E)。未用大豆耕種或用草和雜草覆蓋的土壤儲存在室溫下的盒子中。在武漢市農業科學院檢測中心對樣品的理化性質進行了分析。樣品分別代表三種類型的土壤：酸性(Ac)，堿性(Al)和中性(Ne)，并且土壤中的營養元素含量不同。在以下土壤條件下確定微生物的組成和多樣性：(I)未經處理的天然土壤(Ac，Ne和Al)；(II)熱處理過的土壤(在80°C下處理3次，每次20分鐘；HAc，HNe和HAl)；(III)用50％(w/w)堿性土壤(Ac/Al和Ne/Al)改良的酸性或中性土壤；(IV)用石灰改良的酸性或中性土壤(最終pH 8.2)(圖. 3a)。

使用了慢生根瘤菌屬(B. diazoefficiens USDA110，B.elkanii USDA76和B.japonicum 15781)和中華根瘤菌屬(S.fredii CCBAU45436，J18-31和HH103)的菌株。菌株USDA110，USDA76、15781，J18-3和CCBAU45436由中國農業大學提供；菌株HH103獲自華中農業大學。所有菌株在胰蛋白胨酵母(TY)培養基上于28 °C下生長3-4天，離心(4500 rpm 10 min)沉淀，并重懸于蒸餾水中。

溫室實驗

Greenhouse experiments

用氯氣滅菌的大豆(Glycine max cv.Williams 82)種子分別在裝有上述土壤的盆(10×10cm)中生長。每個盆中播有六粒大豆種子，并將其長期置于溫室中(16小時光照，20°C/28°C，夜/日)。5天后，將幼苗稀疏至3-4顆 /盆，然后根據需要用自來水澆灌植物。根據Bulgarelli和Xiao的描述，在28天時收集了土體土壤，根際，根和根瘤樣品。未種植的土壤樣品用作對照(土體土壤)。每個處理重復4次，每個重復3到4顆幼苗。

16S rRNA基因樣品的制備，測序和分析

16S rRNA gene sample preparation, sequencing, and analysis

總共使用48個未處理的土壤樣品(12個土體土壤，12個根際，12個根和12個根瘤樣品)和56個處理土壤樣品(28個根際和28個根瘤樣品)進行測序。使用E.Z.N.A.^?(Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA)土壤DNA試劑盒提取微生物DNA。使用引物799F和1193R擴增細菌16S rRNA基因的V5-V7高變區。PCR進行如下：95°C下3分鐘；27個循環，循環條件為95°C下30S，55°C下30S，72°C下45S；最終72°C下10分鐘。反應以一式三份的20-μL混合物進行，該混合物包含5×FastPfu緩沖液4μL，2.5μmMdNTP2μL，每種引物(5μM)0.8μL，FastPfu聚合酶0.4μL和10μng的模板DNA。產物從2％的瓊脂糖凝膠中提取，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行純化，并根據制造商的方案使用QuantiFluor?-ST(Promega, Madison, WI, USA)進行定量。根據Majorbio Bio-Pharm Technology Co.Ltd(中國上海)的標準規程，將擴增子以等摩爾濃度合并，并在Illumina MiSeq平臺(Illumina，圣地亞哥，加利福尼亞，美國)上進行雙端測序(2×300)。使用UPARSE以97％的相似性閾值聚類可操作分類單位(OTU)；使用UCHIME鑒定并除去嵌合體序列；使用RDP分類器算法比對到Silva(SSU123)16S rRNA數據庫，以70％的置信度閾值分析了每個16S rRNA序列的物種分類。用Mothur軟件計算Chao1和Shannon的alpha多樣性指數。使用Networkx軟件進行網絡分析。只有Spearman相關系數為|r|>0.6(P <0.05)才被視為指示有效的互作事件。使用R包vegan(version 2.1)進行基于Bray-Curtis距離的主坐標分析(PCoA)。進行線性判別分析和效應尺度測量(LEfSe)分析，以LDA分數至少為3.5尋找兩組之間的顯著差異(P<0.05)的物種分類。

微生物的篩選與鑒定

Microbe isolation and identification

為了從堿性土壤中分離出假定的芽孢桿菌，將1g土壤重懸于無菌磷酸鹽緩沖液中，在150 rpm轉速下孵育30 min，然后將懸浮液在80 °C下熱處理20 min，并螺旋接種于Luria-Bertani (LB) 培養基中。挑選，純化每個菌落類型的代表，通過形態對其進行鑒定，并將其在-80°C下保存在含有20％甘油的LB培養基中，直至進一步使用。通過16S rRNA基因測序確認屬水平上的分離株的物種分類。基因組測序方案是由上海Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd (中國上海)使用Illumina HiSeq 2000系統執行的。使用基因組序列查詢NCBI數據庫以獲得最近鄰序列，并通過JSpeciesWS比較測序分離株的基因組距離。

互作試驗

Interaction assay

將候選菌株接種在5ml的LB培養基中，并以180rpm的轉速于28℃下孵育過夜。將細菌培養物的OD在600nm處調節至0.5。USDA110和CCBAU45436菌株在TY培養基上28°C下生長3-4天，在600nm下將培養物的OD讀數分別調整為1.0和0.5。接下來，將每個候選菌株的分離株或1.5μL懸浮液點在YMA平板上距B. diazoefficiens USDA110 或 S. fredii CCBAU45436 1.2厘米或0.6厘米的位置。將平板在28°C下孵育4-6天。使用Leica顯微鏡(DFC495)捕獲圖像。每種測定進行四次重復。

結瘤試驗

Nodulation assay

將經氯氣滅菌的大豆種植在裝有滅菌蛭石的盆(10×10×10cm)中，生長4天。將植物分別移植到新鮮蛭石上，分別加入和不加入25 mM NaHCO₃和75 mM NaCl。然后，將植物用20 mL B. diazoefficiens USDA110 或 S. fredii CCBAU45436 懸浮液(OD600?=?0.1)接種，并同時用30μmL無菌水(對照)或芽孢桿菌懸浮液(OD 600 = 0.5)處理。根據需要用弱氮營養液(pH 7)給植物澆水。接種和處理28天后，確定了每株植物的結瘤數。每種處理均包括兩份幼苗的四份重復。在相同條件下重復兩次實驗。

為了進行定殖試驗，使大豆植物在蛭石中在與上述相似的條件下生長。用20ml混合的根瘤菌混懸液(USDA110:USDA76:15781:CCBAU45436:J18–3: HH103=1:1:1:1:1:1, OD600=0.1)
共同接種植物，并用30ml的混合芽孢桿菌(3個菌株)混懸液處理(或不處理)(OD600=0.5)。根據需要用弱氮營養液(pH 7)給植物澆水。接種后第28天，收集瘤子，并按照Trabelsi的描述(進行了一些修改)，對瘤子中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌進行了定量。簡而言之，使用E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒(Omega Bio-Tek Inc.，美國喬治亞州諾克羅斯)，從每種處理中提取500 mg類細菌的總DNA。用BioPhotometer D30(Eppendorf)檢查每個DNA樣品的總體質量和數量。使用Bio-Rad CFX Connect Real-Time (Bio-Rad, USA)在96孔板上進行所有定量PCR。屬特異的引物組分別用于分析慢生根瘤菌和中華根瘤菌中的nodC和mlr6601基因。使用CCBAU45436或USDA110基因組DNA的系列稀釋液獲得標準曲線。從每個菌株的標準品得出的循環閾值線性回歸系數計算出慢生根瘤菌和中華根瘤菌的數量，并調整為每微升類細菌DNA溶液的基因拷貝數。每種處理均包括兩顆幼苗的四份重復。在相同條件下重復兩次實驗。

統計分析

Statistical analysis

圖形表示是使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)生成的。計算數據的平均值和標準偏差。Kruskal–Wallis H檢驗用于識別土壤類型之間門或科水平的顯著差異物種。進行了配對的Wilcoxon秩和檢驗，以比較不同土壤類型的α多樣性。進行了置換多元方差分析(PERMANOVA)，以測量效應大小和beta多樣性的顯著性差異。芽孢桿菌和H₂O處理或Mix-R和Mix-R+Bacillus 處理的比較是通過非參數Mann-Whitney檢驗(GraphPad Prism)進行的。

Reference

Qin Han,Qun Ma,Yong Chen,Bing Tian,Lanxi Xu,Yang Bai,Wenfeng Chen,Xia Li. Variation in rhizosphere microbial communities and its association with the symbiotic efficiency of rhizobia in soybean. ISME J (2020) https://doi.org/10.1038/s41396-020-0648-9

通訊作者簡介

李霞教授團隊主要以重要經濟作物大豆為主要研究對象，運用分子遺傳學、生理生化、細胞生物學、各種組學綜合多種手段，系統地研究大豆和根瘤菌識別、根瘤的形態建成及固氮效率調控的遺傳學和表觀遺傳學機制，旨在解析菌植互作和大豆共生固氮調控的分子機制，挖掘具有重要育種價值的基因和優異等位變異。此外，我們對非生物逆境下大豆共生固氮的適應機制非常感興趣。本團隊已經在大豆共生固氮效率表觀調控機制和植物耐逆分子機制方面取得了多項創新性成果，近年來在Nature Communications、ISME J、Molecular Plant、Plant Cell、Plant Physiology、PLoS Genetics、New Phytologist、Plant Journal等國際主流雜志發表了一系列有重要影響力的論文。更多信息請見：http://cpst.hzau.edu.cn/info/1015/1637.htm

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的ISME：华中农大李霞组发现大豆根际微生物组变化与根瘤菌共生效率的关系的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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