PCR 反應(yīng)最大的特點(diǎn)是具有較大的擴(kuò)增能力和極高的靈敏度，正因?yàn)槿绱?#xff0c;極其微量的污染即可造成檢測(cè)結(jié)果的假陽性。監(jiān)控污染，防止污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)后續(xù)生信分析也提出了挑戰(zhàn)。

一、污染原因

1. 交叉污染

(1) 容器被污染。

(2) 標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外。

(3) 容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染。

(4) 標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染。

(5) 有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

2. 試劑污染

PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。

3. 擴(kuò)增產(chǎn)物污染

這是 PCR 污染最主要的形式，因?yàn)?#xff1a;

(1) PCR 產(chǎn)物拷貝量大（一般為 10^{^}13 拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

(2) 最有可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含 48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。

4. 克隆質(zhì)粒污染

(1) 某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題比較常見。

(2) 克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。

二、污染監(jiān)測(cè)

通常使用對(duì)照對(duì)檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，常用的對(duì)照有以下這些。

(一) PCR 中的對(duì)照

1. 陽性對(duì)照與陰性對(duì)照

陽性對(duì)照和陰性對(duì)照是指在相同的處理?xiàng)l件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進(jìn)行了提取和擴(kuò)增最終獲得了陽性結(jié)果和陰性結(jié)果。陰陽性對(duì)照強(qiáng)調(diào)處理過程與樣品一致，并且有明確的預(yù)期結(jié)果。

2. 擴(kuò)增對(duì)照

我們通常說的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照指的是擴(kuò)增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，更準(zhǔn)確的定義應(yīng)該是擴(kuò)增陽性對(duì)照和擴(kuò)增陰性對(duì)照。擴(kuò)增陽性對(duì)照含有陽性擴(kuò)增模板，擴(kuò)增陰性對(duì)照應(yīng)含有陰性擴(kuò)增模板（基質(zhì)核酸）。擴(kuò)增對(duì)照只能監(jiān)控每次擴(kuò)增過程中的擴(kuò)增系統(tǒng)是否正常，不能監(jiān)控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測(cè) RNA 樣品的檢測(cè)試劑盒，其擴(kuò)增陽性對(duì)照使用質(zhì)粒，便無法監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄過程。

3. 內(nèi)標(biāo)（Internal Control, IC）

內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增，而其他的對(duì)照都是獨(dú)立擴(kuò)增。

(1) 內(nèi)參基因

通常它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。內(nèi)參基因通常是管家基因（house-keeping gene）因?yàn)槠浔磉_(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個(gè)體各個(gè)生長階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)變化很小。常用的內(nèi)參基因包括 GAPDH、β-actin (BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT 和 TBP 等。

內(nèi)參基因的優(yōu)點(diǎn)是與樣品中的靶基因經(jīng)歷完全相同的處理程序，可以監(jiān)控采樣，運(yùn)輸，核酸提取和擴(kuò)增的全部過程。缺點(diǎn)是不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液，咽拭子等樣品，內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成功。如果檢測(cè)的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能完全失效。

(2) 人工內(nèi)標(biāo)

添加一種不會(huì)干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成的內(nèi)標(biāo)。現(xiàn)在國外的診斷試劑盒大部分都會(huì)將內(nèi)標(biāo)直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴(kuò)增，但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣，運(yùn)輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內(nèi)標(biāo)，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo)，這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴(kuò)增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細(xì)菌病毒的釋放情況。

4. 核酸提取對(duì)照

可以使用內(nèi)參基因，假病毒混合基質(zhì)，滅活病毒混合基質(zhì)來監(jiān)控提取到擴(kuò)增的流程。

5. 反轉(zhuǎn)錄對(duì)照（RT control）

可以使用提取好的 RNA 內(nèi)參基因，RNA 假病毒混合基質(zhì)，滅活 RNA 病毒混合基質(zhì)來監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄到擴(kuò)增的流程。

無反轉(zhuǎn)錄對(duì)照（no-RT control）含有除反轉(zhuǎn)錄酶以外的所有成分。

6. 空白對(duì)照

(1) 無模板空白對(duì)照

NTC （No Template Control）是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板），但含有引物探針和反應(yīng)液，主要監(jiān)控引物探針、反應(yīng)體系有沒有被污染的對(duì)照。目前的試劑盒的 NC 一般都是水或陰性緩沖液，所以 NC 等同于 NTC。其實(shí)兩者有不同的作用。

(2) 儀器空白對(duì)照

儀器空白對(duì)照通常使用的是空反應(yīng)管來監(jiān)控儀器有無非特異性的熒光信號(hào)。

(3) 熒光染料對(duì)照

最常使用的是 ROX 染料，由于熒光定量 PCR 的熒光信號(hào)在每個(gè)樣品孔會(huì)有微小的差異所以使用特定的 ROX 熒光染料，系統(tǒng)可以根據(jù) ROX 熒光染料的信號(hào)值來校準(zhǔn)每孔的熒光信號(hào)。

7. 質(zhì)控品（Quality control, QC）

上述環(huán)節(jié)中使用的各種對(duì)照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產(chǎn)品，有的是實(shí)驗(yàn)室自制，所以整個(gè)的監(jiān)控過程可能存在不夠客觀和獨(dú)立。因此在實(shí)驗(yàn)室的對(duì)照設(shè)置中每次檢測(cè)都建議使用第三方質(zhì)控品，有條件的使用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (Reference material ,RM)。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確量值和計(jì)量溯源性，可以更準(zhǔn)確的評(píng)估整個(gè)試驗(yàn)流程的準(zhǔn)確度。

8. 定值參考品

醫(yī)學(xué)上的定量檢測(cè)試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測(cè)使用。

(二) PCR 對(duì)照的選擇

從上文可知沒有一種對(duì)照是完美的，在檢測(cè)中我們要根據(jù)自己的需求來進(jìn)行靈活選擇和搭配。筆者建議每一次檢測(cè)時(shí)添加一個(gè)能對(duì)從提取到擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測(cè)樣品中添加內(nèi)標(biāo)（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類型為相對(duì)固定的動(dòng)物組織建議使用內(nèi)參基因）；擴(kuò)增陽性對(duì)照，擴(kuò)增陰性對(duì)照，無模板對(duì)照和 ROX 對(duì)照。有條件的添加臨床陽性對(duì)照和臨床陰性對(duì)照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時(shí)使用核酸提取對(duì)照和反轉(zhuǎn)錄對(duì)照。不定期使用儀器空白對(duì)照。

1. 陽性對(duì)照與污染

不可否認(rèn)的一個(gè)事實(shí)是陽性對(duì)照可以增加實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險(xiǎn)。這種污染的來源一種是直接來源于擴(kuò)增陽性對(duì)照的污染。對(duì)于擴(kuò)增陽性對(duì)照來說通常 10000 拷貝 / 微升（CT 值約 25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴(kuò)增陽性對(duì)照設(shè)置在 CT 值 20 以下，比大部分陽性樣本都強(qiáng)。這么高濃度的對(duì)照給實(shí)驗(yàn)室?guī)砹司薮蟮奈廴撅L(fēng)險(xiǎn)，原因可能僅僅是因?yàn)樵噭S家擔(dān)心其陽性對(duì)照不穩(wěn)定，長時(shí)間存放陽性對(duì)照降解。另一種污染來自于擴(kuò)增產(chǎn)物的處理不當(dāng)，或者實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)布局不合理。

2. 初篩和確診

對(duì)于初篩實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陽性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測(cè)系統(tǒng)達(dá)到最高檢測(cè)效率，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陽性對(duì)照，確保每個(gè)環(huán)節(jié)的檢測(cè)效率最高。

對(duì)于確診實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測(cè)系統(tǒng)不出現(xiàn)假陽性，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陰性對(duì)照，減少非必須的陽性對(duì)照，甚至要在樣品盤的不同位置中隨機(jī)插入幾個(gè)陰性對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)過程中沒有被污染。

三、污染預(yù)防

1. 首要原則

(1) 永遠(yuǎn)要設(shè)置 NTC 對(duì)照：如果不能在污染出現(xiàn)的第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果：一大段時(shí)間的數(shù)據(jù)不可信。

(2) 準(zhǔn)備 PCR 的移液器要專用：千萬不能用吸取 PCR 產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備 PCR 體系。

2. 基本策略

2.1 劃分操作區(qū)

目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

(1) 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備。

(2) 擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和 PCR 擴(kuò)增。

(3) 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

(4) 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備 →PCR 擴(kuò)增 → 產(chǎn)物分析 → 產(chǎn)物處理。

切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

2.2 分裝試劑

PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的 DNA 和其他來源的 DNA。

(1) PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。

(2) 引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制。

(3) 引物和 dNTP 應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

2.3 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意。

(1) 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。

(2) 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與 PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

(3) 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

(4) 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。

(5) 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。

(6) 操作時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照，既可驗(yàn)證 PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。

(7) 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本 DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少 PCR 操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是 PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。

(8) 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

注：本文內(nèi)容來源于網(wǎng)絡(luò)，僅供自己學(xué)習(xí)參考之用。

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從零開始學(xué) PCR 技術(shù)（一）：PCR 技術(shù)簡(jiǎn)介

從零開始學(xué) PCR 技術(shù)（二）：Taq DNA 聚合酶

從零開始學(xué) PCR 技術(shù)（三）：PCR 引物設(shè)計(jì)

從零開始學(xué) PCR 技術(shù)（四）：常見問題

從零開始學(xué) PCR 技術(shù)（五）：試驗(yàn)污染

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的从零开始学PCR技术（五）：试验污染的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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