诺禾--实验篇之荧光定量 PCR（上）
首先，我們還是要一同溫習一下何為熒光定量 PCR。熒光定量 PCR ( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR ）是一種定量實驗技術，經過熒光染料或熒光標志的特異性的探針，對 PCR 產物停止標志跟蹤，實時在線監控反響過程，分離相應的軟件能夠對產物停止剖析，計算待測樣品模板的初始濃度。
概念十分淺顯易懂，但是科研道路上還是有許多無法跳過的關卡，曾讓小編夜不能眠、食不下咽，借此小編將實驗中遇到的問題停止了記載和整理，共享給大家。
Q：要把 qPCR 實驗做，統共分幾步？
A：三步！
Q：哪三步？
A：前期準備、中期操作、后期剖析！
第三步會在下一專題和大家分享，今天先聊聊前兩步：
一、qPCR 實驗前期準備
前期準備主要是提取、反轉錄和引物設計局部，我們來逐一分享。
首先理解一下，RNA 抽提準繩：保證 RNA 的一級構造、無其它物質的污染、得率高、掩蓋一切轉錄本。再比擬一下 Trizol 提取和試劑盒提取，Trizol 提取相對來說耗時長、含有害化學物質、純度低、RNA 完好度不高；而試劑盒提取的優點是效率高、純度高、完好度高，各位可依據實踐科研狀況選擇操作辦法。
RNA 提取留意事項：
① 運用無 RNase 的塑料制品和槍頭，玻璃器皿要消毒，防止穿插污染；運用性能較好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；
② DEPC 有劇毒，當心配制；配制溶液應運用無 RNase 的水；
③ 操作人員應戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套；
④ 樣品應防止重復凍融，否則影響提取 RNA 提獲得率和質量；
⑤ 若下游實驗對 DNA 十分敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 對 RNA 停止處置。
反轉錄留意事項
秉承防止 RNA 被污染和降解的準繩，依照產品闡明書停止即可，細致實驗操作以及留意事項可參照之前已推出文章👉 干貨 | 實驗篇之RT-PCR，此文對反轉錄過程的引物設計和留意事項給出了較明白的提示。
qPCR 引物設計留意事項
qPCR 過程中需求運用基因特異性引物擴增，從而剖析目的基因表達量。
① 引薦運用軟件 Primer Premier 5.0；
② qPCR 過程中運用引物長度引薦 25bp ，擴增產物長度 150bp ，可在 100bp-300bp 之間；
③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超越2℃，Tm 值在 60℃-65℃ 之間為佳；
④ 引物堿基散布要平均，防止呈現連續的4個相同堿基，GC 含量控制在50%左右，3’端最后一個堿基最好為 G 或 C；
⑤ 引物內部或者正反兩條引物間最好防止呈現有3個堿基以上的互補序列；
⑥ 引物特異性需求用 NCBI BLAST 程序停止核對。防止引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補；
⑦ 引物設計完成后需停止擴增效率檢測，將擴增效率相同的引物用于定量比擬剖析。
實驗辦法的選擇
兩步法：退火與延伸相同溫度，最高能夠到達72℃（很少采用），常用60℃，此溫度下擴增引物二聚體和錯配等擴增干擾較少，特異性高；每個循環時間較短，節約時間本錢。
三步法：合適需求較高退火溫度的引物，取得相對嚴謹的數據。
前期準備終了，我們就能夠停止接下來的實驗了，為了防止踩到坑里，請認真閱讀！
二、qPCR 實驗中期操作
中期操作主要分為試劑的存儲、模板制備、體系配制、實驗程序設置和內參選擇幾個局部，詳細內容如下：
試劑貯存
-20℃ 避光長期貯存，防止重復凍融，運用前充沛混勻，但要防止產生氣泡。局部試劑凍結后可能呈現絮狀物質，4℃ 放置并上下顛倒混勻至溶液廓清，不影響試劑性能。
模板的制備
通常 1μg RNA 的反轉錄產物需求稀釋10倍左右，以減輕 RNA 對 PCR 擴增的抑止。梯度稀釋時，Ct 值落在15-28范圍的稀釋倍數作為原始模板稀釋度，在此根底上停止5-10倍稀釋。模板為 cDNA 原液時，上樣量不超越 qPCR 反響總體積的1/10。
體系配制
① 請于超凈工作臺內配制，并運用無核酸酶殘留的槍頭、反響管；引薦運用帶濾芯的槍頭，防止穿插污染和氣溶膠污染。
② 引薦 10μL（q225、NOVO Max100）、20μL、50μL 體系；將引物和 qPCR Mix 混合配成大致系，混合平均，為防止誤差，可多配制1-2個加樣孔的量，保證體系穩定性。
③ 通常引物終濃度為 0.2μM，也能夠依據狀況在 0.1-1.0μM 之間停止調整。
實驗程序設置
① 預變性引薦時間5min，依據不同模板和引物的詳細狀況可恰當縮短至2min。此外，依據不同的廠家的產品能夠有對應的預變性時間。
② 退火溫度依據引物和目的基因的長度恰當調整。
③ 儀器需定期校準，此處整理不同 ROX 適用機型，給各位小同伴參考。
表1 不同熒光染料對應機型
內參基因通常指各種管家基因，各類管家基因在生物體各類細胞中都表達。理想的內參基因可在各類細胞或組織、各種實驗條件下恒定表達。但是不同物種、不同組織的管家基因表達存在特異性，目前還未發現完整理想的內參。下表是已報道的局部物種的 qPCR 內參基因，僅供參考。
表2 已報道局部物種的 qPCR 內參基因
假如表格中的數據無法滿足您的需求，我們再支一招！
首先能夠選擇多個內參基因作為校正規范，再者能夠運用 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 比擬內參基因表達的穩定性，運用軟件 GeNorm、基因芯片數據和 EST 數據庫挑選內參基因。
總結
以上是生活随笔為你收集整理的诺禾--实验篇之荧光定量 PCR（上）的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
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