構建微球原位培養方法實現牛瘤胃重要尿素分解菌分離

Functional gene-guided enrichment plus in situ microsphere cultivation enables isolation of new crucial ureolytic bacteria from the rumen of cattle

Microbiome [IF: 16.837]

DOI：10.1186/s40168-023-01510-4

發表日期：2023-04-15

第一作者: 劉思佳

通訊作者：王加啟 (jiaqiwang@vip.163.com)、趙圣國 (zhaoshengguo1984@163.com)

主要單位：中國農業科學院、蘭州大學、俄亥俄州立大學、英國貝爾法斯特女王大學

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所奶業創新團隊在瘤胃尿素分解菌分離培養方面取得新進展。研究構建了一種基因富集結合微球原位培養的分離方法，實現了微生物高通量分離，并利用該方法從瘤胃中分離鑒定了具有脲酶活性的重要尿素分解菌，大大豐富了瘤胃微生物組資源，有助于彌合未培養細菌基因型和表型之間的鴻溝。相關研究成果于2023年4月發表在《Microbiome》上。

研究背景

在反芻動物中，肝臟產生的尿素有40% - 80%返回胃腸道，特別是瘤胃。返回到瘤胃的尿素被尿素分解菌分泌的脲酶水解為二氧化碳和氨，氨被微生物利用合成微生物蛋白。微生物蛋白是奶和肉的主要氮來源。因此，牧場常使用尿素部分代替反芻動物日糧中的優質蛋白飼料，以降低飼養成本。但是，瘤胃中尿素分解菌分泌的脲酶活性過高，尿素水解過快，導致大量尿素通過尿液排出體外，不僅導致尿素氮利用效率低，還污染環境。因此，瘤胃中的尿素分解菌引起了大量研究者的興趣。

基于培養和測序的研究都試圖揭示瘤胃尿素分解菌的多樣性及其功能。目前，分離培養的瘤胃尿素分解菌大多來自于上個世紀，是通過傳統的平板劃線的方法獲得的，這種方法費時費力。在以往的研究中，只有少數幾種瘤胃尿素分解菌被分離出來，但通過高通量測序技術卻揭示了其具有高度多樣性，有近千個菌種。雖然基于測序技術有助于對瘤胃生態系統中尿素分解菌的多樣性和分布有一些新的認識，但對其代謝、生理和生態仍然知之甚少。瘤胃尿素分解菌的分離和鑒定對于直接評估其基本生物學過程和特征至關重要，這為提高反芻動物尿素利用效率提供了新的、高效的、可行的干預措施。

從瘤胃中分離新的尿素分解菌是困難的，因為它們是厭氧細菌，且在瘤胃中豐度較低。此外，研究者對其營養物質和生長因子的需求知之甚少，無法靶向制定合適的培養基及培養條件。此外，許多微生物在其棲息的自然生態環境中需要交叉喂養或與其他群落成員密切交流才能生長。原位培養是模擬細菌在瘤胃中的生長條件，克服了平板劃線分離方法的缺點，促進了微生物的分離效率。樣品梯度稀釋有助于分離優勢菌群。研究人員開發了幾種新的微生物分離技術，例如芯片、培養組學、單細胞分離和微流控等，以提高從不同環境中分離難以培養細菌的成功率。然而，這些技術需要昂貴的設備，而且分離微生物時并不是針對某些具有特定功能的群體。此外，由于尿素分解菌在瘤胃中的豐度較低，在分離之前進行富集將有助于提高分離效率，但使用選擇性碳或氮源無法有效地富集它們。在本研究中，我們結合ureC基因富集、瓊脂糖微球包裹單細胞和原位共培養的方法從牛瘤胃中分離出尿素分解菌。然后，我們對分離出的尿素分解菌進行全基因組測序，以確定其多樣性和分布，揭示了脲酶基因簇類型和脲酶活性。

1. 靶向分離尿素分解菌方法概述

我們建立了一種靶向分離尿素分解菌的方法，通過功能基因ureC富集靶標菌群，將單細胞包裹到瓊脂糖微球中，在模擬的瘤胃環境中培養，最后通過基因組測序進行鑒定（詳細流程見圖1）。該方法的優點包括：利用96孔板提高了通量；利用功能基因ureCPCR篩選富集靶標菌群；利用瓊脂糖微球包裹置于原位環境中孵育，使需要未知生長因子及需要與其它細菌互作的微生物生長；基因組測序揭示完整的脲酶基因簇特征。我們優化了接種物(瘤胃液)的稀釋度，然后將富集的尿素分解菌群，稀釋后包裹到瓊脂糖微球中。連續稀釋后的瘤胃液于39℃孵育24 h，孵育結束后，利用ureC特異性引物PCR篩選，結果顯示，大于10^-1稀釋度的板子只有部分孔中存在尿素分解菌，10^-5及以上稀釋度的板子中均未檢出尿素分解菌。本研究中，10^-4稀釋度最可能將尿素分解菌分離成單菌株，因此選擇10^-4稀釋度作為富集尿素分解菌的最佳稀釋倍數。

圖1. 瘤胃厭氧尿素分解菌的富集、分離和基因組特征研究流程

我們將富集的尿素分解菌進行梯度稀釋，將其包裹至瓊脂糖微球中，然后在一個模擬瘤胃的環境中進行培養，該系統允許置于透析袋內的瓊脂糖微球中包裹的尿素分解菌與透析袋外的瘤胃微生物群進行交叉喂養。瓊脂糖微球的平均直徑為3.4±0.1mm(±SD)。對每個瓊脂糖微球中菌落的16S rRNA基因擴增并測序分析表明，隨著稀釋度的增加，包裹細菌瓊脂糖微球的比例減少，但包裹單細胞瓊脂糖微球的比例增加。其中10^-9和更高稀釋度的樣品，包裹單細胞微球的比例為100%。為了最大限度地從每個微球中分離出單菌株，我們選擇10^-10稀釋度，進行后續研究中單菌株的分離。

培養時間是影響微球包裹單菌株分離成功的另一個重要因素。隨著孵育時間增加(12-72 h)，含有細菌微球的比例增加，而含有單菌株微球的比例下降。為了最大限度地從每個微球中分離出單菌株，我們選擇孵育24h，進行后續研究中單菌株的分離。

我們采用非靶向代謝組學對透析袋內外的代謝產物進行了分析，以評估透析袋內外微生物代謝產物的差異，確保模擬的瘤胃環境中透析袋外的瘤胃微生物能夠為嵌入在透析袋內瓊脂糖微球中的細菌提供營養物質和生長因子。我們在透析袋和模擬的瘤胃發酵系統中共檢測到4224種代謝物，其中109種可被識別分類。所有這些代謝物均在透析袋放入模擬發酵系統的6 h后被檢測到。通過聚類分析發現，透析袋內外的代謝物分布隨發酵時間的變化而變化，但同一時間基本相似。透析袋內外代謝物在各發酵時間的相關系數為0.96-0.98。

2. 分離的尿素分解菌菌株的基因組學分類

本研究共分離到了976個菌株，其中將16S rRNA基因以100%相似性進行聚類后共得到404個菌株，將16S rRNA基因以98%相似性進行聚類后共得到52個菌株，對這52株菌進行全基因組測序和基因注釋，共得到28株攜帶脲酶基因的菌株。28個菌株的基因組大小范圍為1.8 - 7 Mbp，完整度>90%，污染度<7%。根據平均核苷酸同源性閾值（種<95%、屬<90%），分離到的28株菌分布在11個菌屬12個菌種。利用GTDB-TK軟件對28株菌進行物種分類，結果顯示12個菌種分別為Pseudomonas stutzeri (1株)、Proteus penneri (1株)、Klebsiella pneumoniae (6株)、Enterobacter hormaechei (1株)、E. cloacae (1株)、Citrobacter koseri (2株)、C. farmeri (1株)、C. amalonaticus (2株)、Paraclostridium bifermentans (1株)、Clostridium butyricum (4株)、Aliarcobacter butzleri (3株) 和 Corynebacterium vitaeruminis (5株)。尿素分解菌菌株占基因組測序菌株的48%。除了菌株S90.1 (P. bifermentans)、S92.1 (E. hormaechei)和S48 (E. cloacae)外，其他尿素分解菌基于基因組和ureC構建的系統發育樹基本相似，表明ureC基因可作為尿素分解菌分類的系統發育標記基因。

圖2. 分離的尿素分解菌的物種分類及系統發育

3. 評估微球原位分離方法的先進性

本研究分離出的12種尿素分解菌與之前9項研究中分離出的尿素分解菌不同。與以往所有的研究相比，本研究擴大了分離尿素分解菌的數量。在瘤胃Hungate1000項目中，共有17種尿素分解菌攜帶脲酶基因，根據BacDive數據庫推斷其中3種(1.7%)具有脲酶活性。在之前的10項研究中，共從瘤胃中分離出35種尿素分解菌，根據BacDive數據庫推斷其中24種具有脲酶活性。本研究對12種新分離的尿素分解菌的尿素水解能力進行了測定，結果顯示均可水解尿素。本研究將現有資源庫中攜帶脲酶基因的菌種數量增加了34.38%，具有脲酶活性的菌種數量增加了45.83%。

圖3. 新尿素分解菌與以往研究的比較

4. 新尿素分解菌的分布

我們通過將分離尿素分解菌的基因組序列比對到不同反芻動物(包括山羊、狍子、綿羊、奶牛、牦牛和水牛)的宏基因組，以評估其分布情況。根據匹配率評估尿素分解菌在上述反芻動物瘤胃的相對豐度，以及與尿素攝入量和乳品質的關系。結果顯示，所有新分離的尿素分解菌在上述6種不同反芻動物中都有分布，但相對豐度存在差異。除了狍子、水牛和山羊，來自同一反芻動物物種的菌株聚集在一起。P. penneri、K. pneumoniae、C. koseri、C. farmer?和?C. amalonaticus 在奶牛瘤胃中的相對豐度高于其他5種反芻動物。在相對豐度較高的10個菌株中，有8個來自本研究。與以往的研究相比，本研究分離出的尿素分解菌覆蓋了低豐度菌。我們發現，飼料中添加尿素降低了綿羊瘤胃中A. butzleri、C. vitaeruminis、E. cloacae、C. koseri、C. butyricum和 P. bifermentans?菌株的相對豐度，增加了E. hormaechei、K. pneumoniae和P. stutzeri?菌株的相對豐度。此外，有22株(占總數的51%)尿素分解菌與奶牛乳蛋白水平顯著相關，其中本研究分離的占64%。乳蛋白水平高的奶牛中P. penneri、K. pneumoniae和P. stutzeri?分離株相對豐度較高，C. vitaeruminis、A. butzleri、C. koseri、C. amalonaticus?和?C. butyricum?分離株相對豐度較低。

圖4. 尿素分解菌菌株的相對豐度、分布和作用

5. 尿素分解菌的獨特基因和糖苷水解酶家族

我們將分離到的28個尿素分解菌菌株的基因組與前人分離的尿素分解菌進行了泛基因組比較。所有新分離株均具有獨特的基因家族，占全部基因的0.07% - 9.87%。隨著基因組數量的增加，每個物種的泛基因組大小都在增加，但并沒有達到一個平臺，表明這些物種的泛基因組處于開放狀態。根據獨特基因家族的數量和較高的注釋率，選擇3個物種(C. butyricum、P. bifermentans、K. pneumoniae)進行獨特基因家族的分布研究。我們分別從C. butyricum、P. bifermentans和K. pneumoniae?的基因組中發現了65個、2662個和2637個核心基因家族。C. butyricum共有57株，其中本研究分離到4株，這4株新菌株包含3 - 420個獨特基因家族，其中菌株S11數量最多。P. bifermentans?共有16株，其中本研究分離到1株，包含73個獨特基因家族。K. pneumoniae 共有79株，其中本研究分離到6株，這6株新菌株包含3 - 254個獨特的基因家族。鑒定到的大部分獨特基因家族都與碳氮代謝相關。菌株C. butyricum S11獨特的基因家族涉及脂肪酸代謝、碳水化合物代謝和谷胱甘肽生物合成。菌株P. bifermentans S90.1獨特的基因家族涉及固氮和菌毛合成。K. pneumoniae?菌株獨特的基因家族涉及L-阿拉伯糖、甲酸酯、L-蘇糖醇、D-半乳糖和D-木糖代謝，以及谷胱甘肽、纈氨酸、絲氨酸、鳥氨酸、L-蘇氨酸、丙氨酸、賴氨酸和精氨酸代謝。有趣的是，研究發現K. pneumoniae S26、S96和S97具有一個獨特的尿素代謝基因家族——尿素羧化酶，該基因與脲基甲酸酯水解酶共同發揮作用。

在瘤胃中以多糖為主要的碳源和能量來源，因此我們利用dbCAN和CAZy數據庫分析了28個尿素分解菌菌株的基因組，以揭示糖苷水解酶家族（GHs）的分布。我們鑒定到了參與不同類型多糖水解的GHs，包括淀粉、半纖維素、纖維素和低聚糖。同一物種的不同菌株具有相似的GHs類型和家族。C. amalonaticus、C. farmeri、C. koseri、C. butyricum、E. cloacae、E. hormaechei 和?K. pneumoniae?的菌株均含有淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶和低聚糖降解酶，說明它們可以廣泛利用多糖，有助于反芻動物飼料消化吸收與利用。

圖5. 尿素分解菌泛基因組分析

6. 脲酶基因簇多樣性、脲酶活性及關鍵

氨基酸殘基

脲酶基因在尿素分解菌的基因組中通常以簇的形式出現，包括3個結構基因(ureA、ureB、ureC)和附屬基因。在本研究攜帶脲酶基因的分離株中，我們發現了5種類型的脲酶基因簇。這些基因簇均具有上述3種結構基因，但附屬基因的數量或順序不同。在V型脲酶基因簇中，ureC?和?ureE之間存在多個開放閱讀框。與其他類型相比，IV型和V型脲酶基因簇中包含編碼鎳跨膜轉運蛋白的ureJ。

所有尿素分解菌菌株均具有脲酶活性，但尿素水解和尿素利用能力不同。菌株P. penneri S99的尿素水解率最高，菌株C. amalonaticus S106的尿素水解率最低。同一種菌種不同菌株的尿素水解能力存在差異，如K. pneumoniae、C. koseri、C. amalonaticus 和 A. butzleri。培養基中尿素的水解率分別為K. pneumoniae 20% - 54%、C. koseri 11% - 42%、C. amalonaticus 2% - 27%和A. butzleri 13% - 28%。然而，它們利用尿素水解產生的氨氮的能力與水解尿素的能力并不一致。其中，菌株P. bifermentans S90.1尿素氨氮利用率最高，但尿素水解效率較低。

尿素水解率與脲酶基因簇類型之間沒有關系，相同的脲酶基因簇類型的菌株之間尿素水解能力存在差異。具有脲酶基因簇類型I的菌株尿素水解率變異最大。我們將I類型脲酶基因簇菌株攜帶脲酶活性中心的UreC的氨基酸序列進行比對，以揭示其調控脲酶活性的潛在機制。同一菌種不同菌株的UreC序列幾乎相同(99-100%)，而不同菌種間菌株的UreC序列相似性較低(91-98%)，其中菌株S99的UreC序列與其他菌株/種的UreC序列相似性僅為71-73%。在利用UreC氨基酸序列構建的系統發育樹上，菌株S99單獨為一個分支。我們對菌株S99的UreC活性中心的關鍵催化殘基(His¹³⁴、His¹³⁶、Lys²¹⁷、His²⁴⁶、His²⁷²、Asp³⁶⁰)進行比對，發現菌株S99的UreC活性中心的關鍵催化殘基是保守的。然而，與其他攜帶I型脲酶基因簇的分離株相比，菌株S99在覆蓋活性中心柔性環的皮瓣區域有3個突變的AAs殘基(Val³⁰⁹、Ser³²⁵、Pro³²⁷)。Ser³²⁵和Pro³²⁷位于控制活性中心打開或關閉的轉折區域。這兩個AAs殘基可能是控制S99脲酶活性關鍵位點。

圖6. 脲酶基因簇及分離菌株尿素水解能力的研究

7. 全文結論

本研究采用脲酶基因富集結合微球原位培養的方法，從瘤胃中分離出尿素分解菌。我們分離并鑒定了多種具有脲酶活性的尿素分解菌，這些新分離的菌株以前未從瘤胃中培養過。其中一些新分離菌株可能在氮代謝，特別是尿素代謝中發揮重要作用。這些菌株可作為模型菌進一步了解瘤胃中氮代謝，特別是尿素代謝，以提高尿素利用率。新方法還將有助于分離其他環境中感興趣的未培養微生物，以更好地彌合未培養細菌基因型和表型之間的鴻溝。

資助情況

研究成果于2023年4月發表在《Microbiome》雜志。該成果由國家自然科學基金項目、國家奶牛產業技術體系、中國農業科學院科技創新工程和動物營養學國家重點實驗室自主課題資助.

參考文獻

Sijia Liu, Zhongtang Yu, Huiyue Zhong, Nan Zheng, Sharon Huws, Shengguo Zhao*, Jiaqi Wang*. Functional gene-guided enrichment plus in situ microsphere cultivation enables isolation of new crucial ureolytic bacteria from the rumen of cattle. Microbiome 2023:76

作者簡介

通訊作者

王加啟

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 研究員

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所奶業創新團隊首席專家，農業農村部食物與營養發展研究所所長，全國農業科研杰出人才。主要從事奶牛營養與牛奶質量安全研究。獲得國家科技進步獎二等獎3項，發表SCI論文百余篇，擔任《Journal of Dairy Science》編委。

通訊作者

趙圣國

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 副研究員

2012年獲中國農業科學院博士學位，2011-2012年在澳大利亞CSIRO Livestock Industries做聯合培養博士生，2012-2014年在中國科學院微生物研究所博士后工作，2014年至今在中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所工作。主要從事動物消化道(瘤胃)微生物組學研究，揭示營養素、微生物和動物機體之間的互作關系。主持國家自然科學基金等國家級項目或子課題2項，獲神農中華農業科技獎等科技獎勵3項，入選農業農村部“杰出青年農業科學家”。以第一或通訊作者(含共同)發表論文67篇，其中在Microbiome、Applied and Environmental Microbiology、Frontiers in Microbiology、Journal of Dairy Science等期刊發表SCI論文37篇，出版《益生菌與動物營養——生產、效果和規范》書籍。兼任《Animal》和《生物技術通報》雜志編委，國際學術組織Metaproteomics Initiative和Anaerobic Fungi Network專家組委員。

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的Microbiome | 中国农科院王加启/赵圣国构建微球原位培养方法实现牛瘤胃重要尿素分解菌分离...的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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