rap技术原理_「水深坑多」做分子海绵，你还需要了解这些技术
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做lncRNA/circRNA分子海綿研究，您需要了解這些技術：
1. Northern blot
2. RACE
3. FISH
4. RIP
5. RNA pull down
6. RAP/TRAP
7. 雙熒光素酶檢測
1． Northern blot（RNA印記技術）
技術應用：
1.定性及定量分析基因轉錄水平差異；
2.檢測目的基因是否具有可變剪切產物或者重復序列。
技術原理：
提取質量良好的RNA樣品，并將其固定在硝酸纖維膜或尼龍膜等固相上，加入標記的核酸探針進行雜交。按照堿基互補配對原則，核酸探針會與固相上的RNA同源序列進行互補，加入顯色系統(tǒng)即能顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強弱可以對樣品定性、定量分析。
技術要點：
需要質量好的，且表達量高的RNA樣品，可以先做QPCR檢測。
2． RACE（cDNA 末端快速擴增技術）
技術應用：
獲得lncRNA全長
RACE是一種基于PCR 從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5'和3'末端的有效方法，通過測序可獲得目的mRNA的全長序列。
技術要點：
需要質量好的RNA，多挑克隆以獲得最長最有可能的RNA片段。
3． FISH（熒光原位雜交）
使用特異性探針對RNA進行熒光標記，適用于mRNA/lncRNA/miRNA在細胞/組織中的表達定位檢測。
技術應用：
1.用于組織/細胞miRNA/lncRNA/circRNA的表達定位檢測；
2.用于組織/細胞lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA共定位檢測；
3.用于細胞倍性檢測。
技術要點：
探針特異性要好。
4． RIP（RNA結合蛋白免疫沉淀）
RIP是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調控網絡動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調節(jié)靶點，miRNA/lncRNA/circRNA的結合蛋白如AGO2等。
技術應用：
1.內源檢測miRNA與靶基因3’UTR區(qū)的結合（miRNA-mRNA-AGO2）；
2.內源檢測lncRNA/circRNA-miRNA-AGO2的結合。
技術要點：
準備5*10E7個以上細胞，保證細胞狀態(tài)良好以最大化模擬正常生理狀態(tài)下的RNA與蛋白間的相互作用。
5． RNA pull down(體外研究蛋白質與RNA互作)
使用體外轉錄法表及生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其它成分分離。復合物洗脫后，通過WB或MS檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。
技術應用：
體外研究蛋白與RNA相互作用關系。
技術要點：
在實驗之初，需先獲得目的miRNA/lncRNA/circRNA（調取/合成），設計探針并進行生物素標記。
6． RAP/TRAP (RNA antisense Purification)
RAP方法是通過針對調控RNA設計互補生物素探針組，將RNA拉下來以后，與其共同作用的RNA或蛋白質（RBPs）就會同時被純化獲取，最后將提取的RNA做高通量測序或QPCR，從而得到與目標RNA互作的RNA類型；與此同時，RBPs可以開展western blot驗證或者MS鑒定未知蛋白（RAP-MS）。
簡單來說就是RAP是用circ/lncRNA的反向互補探針組去拉靶circ/lncRNA，再一起把結合在circ/lncRNA上的miRNA（和蛋白）拉下來，做測序或者qPCR。
如果lncRNA/此人從RNA的QPCR（△ct<12），表達太低，就要用TRAP。TRAP是包含了2個載體，一個是構建ncRNA-ms2融合RNA表達載體，另一個是GST-MS2蛋白融合表達載體。MS2蛋白結合ms2頸環(huán)序列，GSH磁珠拉下MS2-GST，再進行檢測。
技術應用：
內源檢測RNA與RNA，或RNA與蛋白相互作用關系。
技術要點：
需要質量好的，且本底表達量高的RNA樣品，如本底表達量低，需要升級為TRAP檢測。
7． Luciferase（雙熒光素酶檢測）
Luciferase是miRNA-靶基因研究中運用的最多的技術。
值得注意的是，對于lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA吸附的研究，做Luciferase實驗的時候還需要考慮到以下因素：挑選的lncRNA和circRNA本身是否具備作為分子海綿的功能。
比如lncRNA表達于細胞核內而不在胞質，或者它們與AGO2蛋白沒有結合（AGO2是lncRNA/circRNA發(fā)揮海綿作用的指示蛋白，分別與吸附的miRNA形成circRNA/lncRNA-miRNA-AGO2蛋白的三元復合物）。
所以在做雙熒光素酶檢測之前，你需要先做以下工作：
1.RIP-qPCR：檢測lncRNA/circRNA是否與AGO2蛋白結合。
2.FISH：查看lncRNA/circRNA與miRNA的表達是否存在共定位。
風險提示：
由于雙熒光素酶載體不能成環(huán)，所以做circRNA/miRNA檢測時并不能完全模擬細胞內環(huán)境。
技術應用：
1.外源檢測miRNA與靶基因RNA3’UTR的結合；（推薦）
2.外源檢測miRNA與lncRNA/circRNA的結合。
3.通常用工具細胞HEK-293（植物系統(tǒng)除外）細胞進行，不需要目的細胞檢測。
技術要點：
兩個熒光素酶最好在同一個載體上，以做背景校正；靶向關系預測要精準；miRNA的mimics最好帶熒光，以排除轉染效率問題。
以上檢測技術的適用性
總結成一張表：
如果每項檢測結果均能指向同一陽性結合結論，
那么恭喜你，分子海綿研究成功！
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