1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式檢測的試劑盒，產(chǎn)品顯示種屬為人，請問能否用于大鼠細(xì)胞的檢測？

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A：可以。因?yàn)锳nnexin V是與PS親和，而PS在不同種屬間應(yīng)該沒差異。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

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2、Q：用流式作細(xì)胞凋亡為什么跟tunel差別那么大啊？？tunel測出來的細(xì)胞凋亡率大概有30%而作流式測出來的凋亡率只有2%（陰性對照0.5%）差別好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI雙染試劑盒，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

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（1）胰酶消化貼壁細(xì)胞，加培養(yǎng)基中止，離心1000轉(zhuǎn)5min

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（2）吸去上清，PBS0.5ml 重懸細(xì)胞（因?yàn)橐偷絼e處作流式，期間路程約1h，戶外溫度約37度）

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（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上機(jī)。

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請問這是什么原因?qū)е碌?#xff1f;

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A：我也用這兩種方法做過凋亡，是存在兩種方法測的凋亡率差別有點(diǎn)大，但還沒有大到你這樣的程度。雙染測的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL測的是凋亡最晚期的事件DNA片段化。而且TUNEL在檢測過程中，把操作損傷細(xì)胞和壞死細(xì)胞當(dāng)作了凋亡細(xì)胞，而且如果TUNEL是肉眼計(jì)數(shù)的話，也會(huì)有判斷上的誤差，所以，往往TUNEL作出來的凋亡率高一點(diǎn)。但如果凋亡率達(dá)到30%，ladder估計(jì)也應(yīng)該跑的出來。雙染雖然是機(jī)器操作，但在調(diào)試補(bǔ)償時(shí)，人為的影響還是挺明顯的，也不是特別的客觀。基線稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，給你的建議是在經(jīng)費(fèi)、時(shí)間允許的范圍內(nèi)再多做幾次吧。感覺這么大的差異，可能這兩種方法都會(huì)存在問題。還有，去流式的路上，裝細(xì)胞的ep管最好插在冰上，拿著冰盒。

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3、Q：可以用液氮保存瘤組織塊，然后再做流式細(xì)胞分析嗎？

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A：我認(rèn)為是不能的。因?yàn)榱魇郊?xì)胞分析要求細(xì)胞分散、單個(gè)，活性好，這樣才能區(qū)分死亡、凋亡和活性細(xì)胞。組織在凍存、復(fù)溫的過程中會(huì)有大量的細(xì)胞死亡，同時(shí)經(jīng)過這一過程的組織在分離成單個(gè)細(xì)胞的時(shí)候會(huì)形成許多細(xì)胞碎片，不宜上流式檢測了，所以用于流式檢測的標(biāo)本最好是新鮮標(biāo)本，即取材后立即檢測，效果最好。

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我以前也試圖將組織存入-80℃，然后進(jìn)行流式檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后來處理的組織細(xì)胞不是粘團(tuán)就是破碎，根本無法檢測。如果你實(shí)在找不到可以檢測的流式細(xì)胞儀，我建議你可以將組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀察組織細(xì)胞的凋亡。

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我們實(shí)驗(yàn)室的腫瘤組織塊一部分凍存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫組化。

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來源：51xxziyuan.com

總結(jié)

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