看了別人文獻里的PCR方法，照搬了人家的引物，還是做得每次結果都不一樣？不是Ct值出現過晚，就是擴增曲線變化很奇怪，總是操作過程中時不時有這樣或者那樣的問題，遇到這些問題怎么處理呢？實踐出真知，今天給大家匯總一下qPCR常見的疑難解答，看下方詳細介紹：

疑問1：Ct值出現過晚（Ct>38）

答：

擴增效率低，反應條件不夠優化，降低退火溫度，增加鎂離子濃度。

反應成分降解或加樣量不足

PCR產物過長，一般采用80-150bp.

疑問2：標準曲線線性關系不佳

答：

加樣存在誤差，是樣品濃度不成梯度。

標準品出現降解，避免反復凍融。

引物或者探針設計不佳。

模板中存在抑制物或模板濃度過高。

疑問3：溶解曲線存在多個主峰

答：

引物設計不夠優化。

引物濃度不佳，上下游引物濃度比例不一致。

鎂離子濃度過高。

模板基因組的污染。

疑問4：同一樣品中，其中某一個熒光信號特別強。

答:

試劑配制時反應液沒有完全溶化，導致探針量在一管增多。

試劑配制時沒有充分混勻致各管中各成分的量不同。

PCR儀熱槽被熒光物質污染，需要清除熱槽中的污染。

疑問5：擴增曲線有一向上或向下的尖峰？

答：

反應過程中電壓不穩定

可能在20個循環左右時，儀器有停下或儀器有開蓋，使光線突然增強

如果尖峰向下，可能是由鹵素燈老化所致，這時應更換。

疑問6：部分樣本擴增效率過低？

答:

提取液殘留，一定程度抑制了PCR反應

反應液未嚴格取量混勻或分裝不均勻

試劑失效

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的qPCR实验疑难杂问解答的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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