1. 引物設計的基本原則是什么？

引物設計的下列原則供您參考：

• 1) 引物最好在模板cDNA的保守區內設計。

• 2) 引物長度一般在15-30堿基之間。

• 3) 引物GC含量在40%-60%之間，Tm值最好接近72℃。

• 4) 引物3′端要避開密碼子的第3位。

• 5) 引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

• 6) 堿基要隨機分布。

• 7) 引物自身及引物之間不應存在互補序列。

• 8) 引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。

• 9) 引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

• 10) 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。

• 11) 引物應具有特異性。

2. 常用引物設計軟件有哪些？

常用的軟件有Oligo 6和Primer Premier 5.0。引物設計軟件是根據引物設計的指導意見設計而成。其實，PCR擴增的成敗最關鍵的是反應模板的制備和反應條件的控制。引物設計軟件的缺點是，有時判斷為該基因沒有一段區域滿足標準引物的要求。

金斯瑞為您提供以下引物設計相關軟件：

• 引物計算工具

• 引物設計工具

• 測序引物設計軟件

• Real-time PCR 引物設計軟件

3. 文獻上找到的引物和探針序列能否直接使用？

通常國外的文獻可信度比較高，可直接使用；但為了保險起見，最好用blast對引物探針的序列進行必要的驗證；或者再進一步用引物設計軟件對引物探針的二級結構和退火溫度進行分析，這樣更有利于您對整個實驗的把握。

4. 如何計算引物的Tm值？

Tm值的概念：
DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度，亦即DNA 變性過程中，紫外吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為 DNA 的解鏈溫度(Tm)。

金斯瑞采用以下方法計算Tm值：
長度為20mer及以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。但這個公式只適用于14~20個堿基的引物，引物的TM值還與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖溶液的離子強度等有關。
對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5
注：L：引物堿基數；% of GC：引物GC含量；% of GC = GC個數/引物總堿基數

5. 常見的引物修飾的有哪些?

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的引物的设计及修饰最全教程的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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