Cell Reports：CRISPR-Cas12k引导的细菌普适性靶向遗传筛选系统
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近日，中山大學(xué)駱觀正課題組與上?？萍即髮W(xué)季泉江課題組合作，在Cell Reports雜志發(fā)表了題為“Targeted genetic screening in bacteria with a Cas12k-guided transposase”的研究論文，開(kāi)發(fā)了名為Site-specific Transposon-Assisted Genome Engineering （STAGE）的新方法，該方法允許在多種微生物（例如銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌）中進(jìn)行高通量的Cas12k介導(dǎo)的基因敲除篩選。在這里附上文獻(xiàn)詳解以饋?zhàn)x者。
微生物基因組的多樣性使微生物種群能夠快速適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。為了研究未探索的基因組功能，高通量基因組編輯和篩選是基因型-表型關(guān)系功能分析和了解細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的主流方法。隨著高通量的DNA合成技術(shù)和高通量測(cè)序(NGS)的進(jìn)步，并行產(chǎn)生準(zhǔn)確和特定突變的高通量方法已不是基因組規(guī)模分析的瓶頸。目前幾種高通量基因工程方法，例如Tn-seq、MAGE、TRMR和CREATE已被開(kāi)發(fā)用于細(xì)菌中的快速基因組大規(guī)模誘變。Tn-seq已被廣泛應(yīng)用于不同細(xì)菌物種中，是構(gòu)建基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)座子誘變文庫(kù)的經(jīng)典策略。然而，靶向非特異性基因組位點(diǎn)使得該方法無(wú)法構(gòu)建位點(diǎn)特異性誘變文庫(kù)，通常需要后續(xù)大量的篩選來(lái)分離所需的突變。相比之下，由同源重組介導(dǎo)的高通量基因工程方法（例如MAGE和TRMR）使得在大腸桿菌中位點(diǎn)特異性的基因組整合成為可能。然而由于其他細(xì)菌物種可能缺乏有效的噬菌體重組蛋白，使得這些方法在其他菌種中不像在大腸桿菌中那樣有效。最近，兩個(gè)CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)被報(bào)道稱可在大腸桿菌中使用gRNA來(lái)介導(dǎo)高效和位點(diǎn)特異性基因組轉(zhuǎn)座，而不依賴于同源重組。鑒于其可編程性、高效率和可操作性，該技術(shù)是用于位點(diǎn)特異性基因組規(guī)模誘變的理想高通量基因工程工具。
銅綠假單胞菌中ShCAST系統(tǒng)的構(gòu)建
CRISPR-Cas12k引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)是一種由Cas12k、sgRNA、TniQ/TnsBC轉(zhuǎn)座酶構(gòu)成的定向轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。利用Cas12k/gRNA復(fù)合物的基因組識(shí)別和定位功能， TniQ/TnsBC能夠?qū)崿F(xiàn)藍(lán)藻細(xì)菌基因組的定向轉(zhuǎn)座。為了評(píng)估該系統(tǒng)是否適用于其他細(xì)菌物種，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了一個(gè)基于雙質(zhì)粒的ShCAST系統(tǒng)，以鑒定該系統(tǒng)在銅綠假單胞菌中的整合效率。其中pCASTPA質(zhì)?？梢栽贚-阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PBAD的控制下表達(dá)TnsB、TnsC、TniQ和Cas12k蛋白，而pGTPA質(zhì)粒包含gRNA表達(dá)盒和轉(zhuǎn)座子供體DNA（圖1）。此外，反選擇標(biāo)記sacB也被組裝到兩個(gè)質(zhì)粒中，在蔗糖存在下sacB會(huì)變成致死基因，可用于轉(zhuǎn)座后的質(zhì)粒篩選。
圖1
我們將含有九個(gè)不同Spacer的pGTPA質(zhì)粒分別電穿孔到攜帶pCASTPA質(zhì)粒的銅綠假單胞菌PAO1菌株中。培養(yǎng)后通過(guò)使用與目標(biāo)基因組位點(diǎn)相鄰的引物和位于轉(zhuǎn)座子供體DNA內(nèi)的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確認(rèn)，在9個(gè)測(cè)試位點(diǎn)均發(fā)生了成功的轉(zhuǎn)座事件（圖2）。證明了雙質(zhì)粒的ShCAST系統(tǒng)可以應(yīng)用于銅綠假單胞菌。
圖2
之后為了仔細(xì)評(píng)估ShCAST系統(tǒng)在銅綠假單胞菌中的插入頻率，我們將eGFP作為轉(zhuǎn)座子供體DNA組裝到pGTPA質(zhì)粒中。在靶向rhlR和lasR基因時(shí)，分別在921個(gè)總菌落中觀察到10個(gè)明亮菌落，在657個(gè)總菌落中觀察到8個(gè)明亮的菌落。此外，定量PCR(qPCR)分析顯示，9個(gè)測(cè)試位點(diǎn)的整合效率范圍為10-5到10-2，與eGFP轉(zhuǎn)座分析的結(jié)果一致（圖3）。
圖3
此外為了進(jìn)一步擴(kuò)展ShCAST系統(tǒng)在不同細(xì)菌中的多功能性，我們將ShCAST系統(tǒng)應(yīng)用于肺炎克雷伯氏菌，這是一種重要的工業(yè)微生物和主要的人類病原體。與銅綠假單胞菌的結(jié)果相似，肺炎克雷伯菌基因組中的10個(gè)測(cè)試位點(diǎn)都成功地被轉(zhuǎn)座子DNA整合，但是整合的頻率相對(duì)較低。
ShCAST系統(tǒng)在銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌中的低整合效率阻礙了成功轉(zhuǎn)座菌種的分離。因此我們?cè)噲D使用抗生素選擇來(lái)富集包含成功插入轉(zhuǎn)座DNA的陽(yáng)性菌種。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，我們使用慶大霉素抗性基因作為轉(zhuǎn)座子供體DNA。并在菌種發(fā)生編輯后，在含有蔗糖和慶大霉素的Luria-Bertani(LB)板上選擇菌落。蔗糖用于去除含有游離質(zhì)粒或整合到細(xì)菌基因組中的質(zhì)粒的細(xì)胞，而慶大霉素用于篩選成功整合因此含有慶大霉素抗性基因的菌種（圖4）。
圖4
在用慶大霉素和蔗糖選擇后，銅綠假單胞菌中的所有測(cè)試基因都實(shí)現(xiàn)了高效率的富集。此外，隨機(jī)挑選三個(gè)菌落進(jìn)行納米孔測(cè)序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子供體DNA成功插入目標(biāo)位點(diǎn)，同時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到脫靶整合或剩余質(zhì)粒。
STAGE突變文庫(kù)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
鑒于ShCAST系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座的能力和選擇后陽(yáng)性轉(zhuǎn)座事件的高富集效率，研究試圖在銅綠假單胞菌中構(gòu)建一個(gè)集中的TF庫(kù)，以便對(duì)TF功能進(jìn)行全面分析。我們根據(jù)NCBI和已有的基因注釋，將銅綠假單胞菌PAO1菌株中的593個(gè)帶注釋的TF確定為靶基因，為每個(gè)靶基因設(shè)計(jì)并選擇了15個(gè)sgRNA，一共8891個(gè)sgRNA靶向593個(gè)TF。除此之外我們還設(shè)計(jì)了100個(gè)靶向10個(gè)必須基因的sgRNA作為陰性對(duì)照。同時(shí)在sgRNA的3'和5'端添加與pGTPA的質(zhì)粒骨架同源的25個(gè)核苷酸序列，以促進(jìn)sgRNA文庫(kù)的組裝（圖5）。
圖5
在芯片合成sgRNA文庫(kù)后，我們將sgRNA文庫(kù)組裝到pGTPA質(zhì)粒中。對(duì)質(zhì)粒的NGS分析顯示100%的spacer序列以低偏差存在于質(zhì)粒文庫(kù)中。將質(zhì)粒文庫(kù)電穿孔到含有pCASTPA的PAO1菌株中生成突變菌種文庫(kù)。在用蔗糖和慶大霉素篩選后，收集到大約2.6×106個(gè)菌落，達(dá)到了sgRNA質(zhì)粒文庫(kù)~290倍的覆蓋率，保證了文庫(kù)的完整性。
STAGE突變文庫(kù)的高通量測(cè)序分析
為了評(píng)估構(gòu)建的STAGE菌株庫(kù)的質(zhì)量，我們通過(guò)向每個(gè)插入片段引入唯一分子標(biāo)識(shí)符(UMI)來(lái)設(shè)計(jì)定量擴(kuò)增子測(cè)序策略。在對(duì)NGS文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序后，計(jì)算UMI數(shù)以表示靶向插入事件的頻率（圖6）。
圖6
首先我們確定了每個(gè)插入位點(diǎn)與設(shè)計(jì)的spacer的最近識(shí)別位點(diǎn)之間的距離，大多數(shù)插入事件發(fā)生在識(shí)別位點(diǎn)下游的60-70個(gè)堿基對(duì)(bp)，與大腸桿菌中ShCAST系統(tǒng)的插入模式一致（圖7A）。此外，我們還觀察到5bp重復(fù)插入事件，這是Tn7轉(zhuǎn)座產(chǎn)物的標(biāo)志性特征。而在整個(gè)基因組中插入事件中，發(fā)現(xiàn)總reads的約93%位于目標(biāo)位點(diǎn)附近。對(duì)NGS數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析顯示，92.9%的設(shè)計(jì)spacer序列下游存在插入事件，且覆蓋了98.48%的靶基因，未檢測(cè)到所有針對(duì)10個(gè)必需基因（陰性對(duì)照）的插入事件。大多數(shù)靶基因中均鑒定到了超過(guò)10個(gè)以上的sgRNA介導(dǎo)的插入事件，這些插入事件發(fā)生的頻率很高（圖7B）。值得注意的是，插入頻率在目標(biāo)靶基因之間差異很大（圖7C）。為了評(píng)估插入頻率是否反映了局部序列特征，我們計(jì)算了可能影響gRNA識(shí)別的多個(gè)因素，包括PAM序列、GC含量、相對(duì)于目標(biāo)基因的相對(duì)位置和基因組命中分?jǐn)?shù)。然而，插入頻率與這些因素僅微弱相關(guān)。環(huán)境壓力和不同轉(zhuǎn)座子突變體的生長(zhǎng)速度也可能會(huì)干擾插入頻率的鑒定。通過(guò)將sgRNA質(zhì)粒文庫(kù)的豐度與相應(yīng)靶基因的插入讀數(shù)進(jìn)行比較，我們注意到靶基因內(nèi)部所有插入事件總體的插入讀數(shù)分布與原始質(zhì)粒豐度顯著不同，表明STAGE文庫(kù)的插入頻率在培養(yǎng)過(guò)程中受到了影響。我們進(jìn)一步分析了插入頻率顯著變化的目標(biāo)基因，揭示了插入頻率降低或增加的兩個(gè)基因類別（圖7D）。這一結(jié)果表明，這些基因的破壞會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致這些突變體的快速生長(zhǎng)或死亡。
圖7
而在插入頻率低的基因中，除了10個(gè)必需基因的陰性對(duì)照組外，我們?cè)赟TAGE菌株庫(kù)中還觀察到14個(gè)不可編輯基因。其中ptrB、mucA、rsmA和glnK四個(gè)基因被Tn-seq識(shí)別為必需基因。而之前的研究表明，這四個(gè)基因都能夠在銅綠假單胞菌中成功刪除，因此這些基因的重要性存疑。總之，這些結(jié)果表明，ShCAST介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子篩選是一種強(qiáng)大而可靠的必需基因鑒定方法。
STAGE文庫(kù)抗生素耐藥相關(guān)基因的鑒定
銅綠假單胞菌是ICU、老年患者和燒創(chuàng)傷患者局部感染和全身感染的常見(jiàn)病原菌。近年來(lái)，銅綠假單胞菌的感染率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，同時(shí)耐藥性也日益嚴(yán)峻，因此迫切需要闡明耐藥機(jī)制并開(kāi)發(fā)治療方法。我們?cè)噲D使用STAGE文庫(kù)確定導(dǎo)致銅綠假單胞菌抗生素耐藥性的基因和相關(guān)途徑。我們用三種不同的臨床相關(guān)抗生素(亞胺培南，頭孢他啶和氧氟沙星)處理STAGE突變文庫(kù)。暴露于亞致死水平的抗生素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)的分化，從而使耐藥突變體在培養(yǎng)過(guò)程中富集，而抗生素敏感突變體逐漸被消除（圖8）。
圖8
我們對(duì)所有樣品進(jìn)行了NGS分析，在對(duì)照組和抗生素處理組之間沒(méi)有明顯的插入分布差異，這表明大多數(shù)TF突變體的相對(duì)生長(zhǎng)沒(méi)有受到顯著影響抗生素治療（圖9A）。通過(guò)比較抗生素處理樣品中每個(gè)靶基因的插入讀數(shù)與未處理對(duì)照樣品的插入讀數(shù)，我們能夠識(shí)別出與抗生素抗性有關(guān)的基因。首先對(duì)亞胺培南處理樣品分析，確定ampG、mucB、ampC、ampR、hptB、dksA、rsmA和algU基因的破壞會(huì)增加細(xì)菌對(duì)亞胺培南的易感性，幾乎所有的靶向這八個(gè)基因的插入讀數(shù)同時(shí)下降，支持了在亞胺培南存在下這些基因的破壞確實(shí)會(huì)減少細(xì)菌生長(zhǎng)的觀點(diǎn)（圖9B、9C）。類似地，在頭孢他啶處理后，靶向mexR、nalC和nalD基因的插入讀數(shù)上升，表明這些基因的破壞有助于頭孢他啶耐藥。相反，algU、ampDh2和dksA基因的破壞降低了細(xì)菌對(duì)頭孢他啶的耐藥性。此外，確定了mexR、mexZ、nfxB、nalC和nalD基因的突變可以提高細(xì)菌對(duì)氧氟沙星的耐藥性。在三個(gè)處理組中確定的基因中，我們注意到一些基因涉及兩個(gè)或更多的處理組，這表明可能存在某些多藥耐藥性的普遍機(jī)制（圖9D）。
圖9
突變體重建驗(yàn)證已識(shí)別的抗性/敏感基因
為了驗(yàn)證從STAGE文庫(kù)中鑒定出的基因在抗生素耐藥性中的作用，我們使用基于CRISPR-Cas9的基因組編輯技術(shù)重建了可靠的突變體。mucB、rsmA、hptB或dksA基因的失活顯著降低了細(xì)菌對(duì)亞胺培南的耐藥性。值得注意的是，當(dāng)在亞胺培南存在下使algU失活時(shí)，沒(méi)有觀察到突變菌株的生長(zhǎng)。在頭孢他啶存在的情況下，mexR和nalD突變體的生長(zhǎng)速度比野生型菌株快，而algU、dksA和ampDh2突變體的生長(zhǎng)明顯受到抑制。此外，mexR、mexZ或nalD基因的破壞增加了細(xì)菌對(duì)氧氟沙星的耐藥性（圖10）。所有這些表型都可以通過(guò)重新引入野生型基因來(lái)恢復(fù)。此外，我們檢查了algU、mexZ和dksA基因在其他兩種銅綠假單胞菌菌株P(guān)AK和PA14中的抗生素抗性作用，其結(jié)果與PAO1菌株的結(jié)果一致。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明STAGE方法是一種有效且可靠的工具，可用于基因型-表型關(guān)系的高通量分析。
圖10
在從STAGE文庫(kù)鑒定的基因中，ampG、ampC、ampR和mucB先前已通過(guò)全基因組轉(zhuǎn)座子篩選被鑒定為與亞胺培南抗性有關(guān)。MexR、NalC和NalD是MexAB-OprM多藥外排泵的阻遏物。這些基因的失活會(huì)上調(diào)MexAB-OprM泵的表達(dá)，從而增加細(xì)菌對(duì)頭孢他啶和氧氟沙星的耐藥性。MexZ和NfxB分別是MexXY-OprD和MexCD-OprJ外排泵的阻遏物。mexZ和nfxB基因的失活導(dǎo)致MexXY-OprD和MexCD-OprJ外排泵的過(guò)度表達(dá)，從而導(dǎo)致氧氟沙星抗性。algU基因是參與藻酸鹽生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以影響生物膜的形成，從而影響對(duì)抗菌劑的抗性，因此algU的突變導(dǎo)致菌株對(duì)亞胺培南和頭孢他啶敏感。rsmA、dksA、hptB和ampDh2基因在細(xì)菌對(duì)亞胺培南或頭孢他啶的耐藥性中的作用僅在本研究中發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控機(jī)制尚不清楚（圖11）。
圖11
綜上所述，在這項(xiàng)研究中，我們報(bào)告了STAGE的方法，這是一種使用Cas12k引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶在不同微生物物種中進(jìn)行高通量位點(diǎn)特異性基因組工程的方法。除基因破壞外，STAGE還可用于將功能基因組元件高通量整合到不同微生物物種的目標(biāo)基因組位點(diǎn)中，這是以往依賴同源重組或隨機(jī)轉(zhuǎn)座子誘變的方法難以實(shí)現(xiàn)的。這種方法也可用于混合細(xì)菌群落中的多重基因破壞和物種特異性遺傳操作。轉(zhuǎn)座酶組件的未來(lái)工程和進(jìn)化可以提高該系統(tǒng)的靶向特異性，并可能擴(kuò)大其在真核細(xì)胞中的應(yīng)用。
上?？萍即髮W(xué)副研究員陳未中和駱觀正實(shí)驗(yàn)室博士生任澤慧為本論文共同第一作者，駱觀正實(shí)驗(yàn)室博士生柴國(guó)師參與了工作，上?？萍即髮W(xué)季泉江教授和中山大學(xué)駱觀正教授為共同通訊作者。本研究受到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金和廣東省自然科學(xué)基金的支持。
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https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109635
文 / 任澤慧
編 / 陳鴻萱
審 / Don
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生物信息與表觀組學(xué)
ID｜luolab2017
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總結(jié)
以上是生活随笔為你收集整理的Cell Reports：CRISPR-Cas12k引导的细菌普适性靶向遗传筛选系统的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。
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