文章解讀：Tiger

文章校對：生信寶典

Summary:

Single-cell technologies have described heterogeneity across tissues, but the spatial distribution and forces that drive single-cell phenotypes have not been well defined. Combining single-cell RNA and protein analytics in studying the role of stromal cancer-associated fibroblasts (CAFs) in modulating heterogeneity in pancreatic cancer (pancreatic ductal adenocarcinoma [PDAC]) model systems, we have identified significant single-cell population shifts toward invasive epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and proliferative (PRO) phenotypes linked with mitogen-activated protein kinase (MAPK) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling. Using high-content digital imaging of RNA in situ hybridization in 195 PDAC tumors, we quantified these EMT and PRO subpopulations in 319,626 individual cancer cells that can be classified within the context of distinct tumor gland “units” Tumor gland typing provided an additional layer of intratumoral heterogeneity that was associated with differences in stromal abundance and clinical outcomes. This demonstrates the impact of the stroma in shaping tumor architecture by altering inherent patterns of tumor glands in human PDAC.

研究背景

單細(xì)胞技術(shù)可以描述不同組織之間的異質(zhì)性，但驅(qū)動單細(xì)胞表型的空間分布和條件是不太相同的。結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)研究間質(zhì)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）在調(diào)節(jié)胰腺癌（胰腺導(dǎo)管腺癌[PDAC]）模型系統(tǒng)異質(zhì)性中的作用，作者發(fā)現(xiàn)了明顯的細(xì)胞群體之間的轉(zhuǎn)化，包括：侵襲性上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化（EMT）和增殖（PRO）與絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子3 （STAT3）信號通路有關(guān)。作者在195個(gè)PDAC腫瘤中使用高內(nèi)涵數(shù)字成像觀察RNA的原位雜交，在319,626個(gè)個(gè)體癌細(xì)胞中對EMT和PRO亞群進(jìn)行定量。腫瘤腺體分型提供了更為詳細(xì)的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性分型，且該分型與基質(zhì)豐度和臨床結(jié)果的差異有關(guān)。這證明了基質(zhì)通過改變?nèi)薖DAC中腫瘤腺體的固有模式來改變腫瘤結(jié)構(gòu)的影響。

研究方案

Sample: 92 PDAC and 92 CAF cells across conditons;

作者分別用已經(jīng)經(jīng)過熒光標(biāo)記的細(xì)胞系GFP-熒光素酶胰腺癌細(xì)胞系（PDAC-3）和mCherry CAF細(xì)胞系（CAF-1）以不同的比例（100:0,50:50,30:70,10:90）進(jìn)行共孵育（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)真是值得學(xué)習(xí)，說實(shí)話我們?nèi)绻O(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該不會設(shè)計(jì)10:90這個(gè)比例，總感覺CAF細(xì)胞太多可能會影響胰腺癌細(xì)胞與CAF細(xì)胞之間的互作。。。）；

單細(xì)胞建庫流程：SMART-Seq

測序數(shù)據(jù)分析介紹

工具: SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing-v3 kit;

比對: hg38 genome(GRCh38.79) using the STAR v2.4.0h alinger with default settings.

篩選：Genes with fewer than 10 reads in fewer than 5 samples were excluded from analysis, as were samples with fewer than 7000 genes with 5 or more reads.

基因差異分析：作者并沒有利用單細(xì)胞的分析流程，直接進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的差異分析（DESeq2）;(從作者的描述語言中，哈哈其實(shí)可以看出作者并不擅長生物信息分析，所以寫的都比較“詳細(xì)” （寫的其實(shí)不太規(guī)范化），可能有人會覺得是不是測序深度較深所以作者應(yīng)用了DESeq2進(jìn)行差異分析，也可能是這樣的，哈哈哈，但我不信。生信寶典注：方法描述還是挺細(xì)致的，參數(shù)和原理的都有描述，用的DESeq2是作者優(yōu)化后的，說作者不擅長生信分析是有些誤解。 通訊作者M(jìn)artin J. Aryee是統(tǒng)計(jì)學(xué)、表觀研究方向的，生信分析經(jīng)驗(yàn)應(yīng)該比較多。只是有一點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄組分析中不太常用,未見作者的解釋：Duplicate reads were marked using the MarkDuplicates tool in picard-tools-1.8.4 and were removed.）

基因富集分析：Gene set enrichment analysis using Broad Institute MsigDB v5.0;

結(jié)果分析

(1) 與PDAC細(xì)胞共培養(yǎng)的CAF細(xì)胞導(dǎo)致患者衍生的PDAC細(xì)胞系中EMT和PRO表型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性;為了理解基質(zhì)微環(huán)境對PDAC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的影響，作者利用GFP-熒光素酶胰腺癌細(xì)胞系（PDAC-3）和mCherry CAF細(xì)胞系（CAF-1）來分離每種細(xì)胞；以不同比例（50:50,30:70和10:90 PDAC:CAF）共培養(yǎng)PDAC細(xì)胞和CAF 72h后，進(jìn)行scRNA-seq測序；作者發(fā)現(xiàn)一組186個(gè)差異表達(dá)的基因，51個(gè)基因下調(diào) (PDAC only)，而135個(gè)基因響應(yīng)于CAF共培養(yǎng)而上調(diào) (PDAC:VAF=10:90)。GSEA分析發(fā)現(xiàn)這些基因集富集在PRO (HALLMARK_E2F_TARGETS) 和EMT (HALLMARK_
EPITHELIAL_ MESENCHYMAL _TRANSITION)通路，其代表性基因表達(dá)如圖C；作者發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)條件為10:90的PDAC:CAF條件中存在PRO和EMT（DP，雙陽性）表型的癌細(xì)胞亞群；在沒有CAFs的情況下，65％的PDAC細(xì)胞是PRO、EMT雙陰性（DN）表型，而在50:50的PDAC:CAF共培養(yǎng)條件下，PDAC細(xì)胞從這種DN狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镻RO，EMT單陽性或雙陽性細(xì)胞的混合物；將100%CAFs與50:50 PDAC：CAF條件下進(jìn)行差異分析產(chǎn)生3,059個(gè)差異表達(dá)基因（FDR <0.2），其中2,158個(gè)基因上調(diào)，901個(gè)基因下調(diào)。其中，PDAC細(xì)胞上調(diào)的基因富集在增殖功能的相關(guān)通路上，CAF細(xì)胞上調(diào)基因特異性富集在炎性干擾素反應(yīng)相關(guān)通路。（其實(shí)炎性的間質(zhì)細(xì)胞并不是特別新的東西，但利用單細(xì)胞層面對腫瘤細(xì)胞的炎癥環(huán)境進(jìn)行分析是一個(gè)既相對簡單又重要的研究課題）

MET和PRO定義：The genes used for the Proliferation (Pro) and EMT meta-signatures were chosen as the 15 genes from the HALLMARK_E2F_TARGETS and HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL _TRANSITION gene sets that
had the most negative median correlation with genes of the other gene set. Meta-signature scores for each cell were calculated as the mean expression rank for the 15 genes that comprise the given meta-signature.（常用表征方式，值得學(xué)習(xí)和借鑒）

(2) CAF條件培養(yǎng)基（CAF-CM）（其實(shí)就是CAF分泌的因子）對不同的PDAC細(xì)胞系的PRO和EMT表型的影響;作者發(fā)現(xiàn)在三種不同的CAF-CM中均發(fā)現(xiàn)了相對較高的PRO和EMT表型的細(xì)胞，并且作者在免疫缺陷小鼠中注射入不同比例PDAC-3和CAF細(xì)胞組成的胰腺原位腫瘤，并使用體內(nèi)熒光素酶成像進(jìn)行體內(nèi)觀察，發(fā)現(xiàn)10:90 PDAC：CAF腫瘤中原發(fā)腫瘤生長明顯更快（4周時(shí)與對照組相比大7.9 3），但在30:70 PDAC：CAF中沒有腫瘤；與單獨(dú)的PDAC細(xì)胞相比，在PDAC：CAF原位腫瘤中觀察到增加的轉(zhuǎn)移性腫瘤負(fù)荷。（作者只是想說明基質(zhì)的變化將會導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致增殖能力和轉(zhuǎn)移能力明顯增加）

(3) CAF-CM激活不同PDAC細(xì)胞系的DP細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），并激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 （STAT3）信號通路;鑒于在CAF-CM存在下PDAC細(xì)胞向EMT和PRO表型轉(zhuǎn)變，作者想要鑒定由于CAF-CM暴露而在PDAC細(xì)胞中激活的途徑中的信號。在5分鐘，15分鐘，1小時(shí)，3小時(shí)和24小時(shí)對暴露于CAF-CM的PDAC-3細(xì)胞進(jìn)行基于時(shí)程且基于質(zhì)譜的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)揭示了EMT和PRO蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的顯著富集，包括MAPK途徑的早期活化（MEK / ERK）隨后在24小時(shí)有關(guān)STAT3通路的基因表達(dá)上調(diào)（STAT3）。

(4)CAF分泌的轉(zhuǎn)化生長因子b（TGF-β）驅(qū)動PDAC細(xì)胞系中的DP表型;作者對無血清CAF-CM和無血清PDAC-CM進(jìn)行了質(zhì)譜分析并比較了CAF和PDAC分泌蛋白組學(xué)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1是PDAC細(xì)胞系中增殖能力獲得的重要貢獻(xiàn)者。并且作者利用RNA-ISH確定了在原發(fā)性PDAC腫瘤中的EMT和PRO的表型；

(5) 基質(zhì)含量與人原發(fā)性PDAC腫瘤中腫瘤腺體的不同模式相關(guān);不同細(xì)胞類型（DP，EMT，PRO和DN）對患者預(yù)后結(jié)果的影響是不同的，同時(shí)也表明存在不同的腫瘤腺體類型。作者根據(jù)其腫瘤腺體細(xì)胞組成定義了8種不同類型的腫瘤腺體并且發(fā)現(xiàn)人類PDAC腫瘤中基質(zhì)含量與腺體異質(zhì)性確實(shí)存在相關(guān)性。作者觀察到不同基質(zhì)含量下含有不同細(xì)胞類型（DP，EMT或PRO）的腺體類型的富集：DP腺體（I型）僅在高基質(zhì)腫瘤中富集，中基質(zhì)腫瘤中EMT腺體（II型和IV型）低基質(zhì)腫瘤PRO腺體（III型）中顯著富集。并且作者發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤主要含有DP或EMT細(xì)胞的腺體（I型，II型，和IV）與惡化的患者生存率顯著相關(guān)。

單細(xì)胞文章點(diǎn)評

該篇文章總感覺不是通過單細(xì)胞測序篩選出的調(diào)控基因的up和down，作者很有可能是做完了后面的實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)利用單細(xì)胞測序可以幫助文章提高檔次，所以就利用了單細(xì)胞測序；

作者沒有利用單細(xì)胞的分析思路，只是利用了普通轉(zhuǎn)錄組的基因差異分析；（其實(shí)，如果你細(xì)看***Cell Immunity***的文章的話，你會發(fā)現(xiàn)大部分都是這樣的，單細(xì)胞分析確實(shí)可以幫助提高檔次）

作者的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的思路是值得好好學(xué)習(xí)的，尤其是在以不同比例的腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞混合后查看差異分析，用這樣的方法，多數(shù)的腫瘤其實(shí)都是值得做一做的；（比如肺癌與其間質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系，甚至可以做肺癌-間質(zhì)細(xì)胞-炎癥的關(guān)系，或者有許多其他腺癌，肺中的間質(zhì)細(xì)胞類型較多）

在應(yīng)用單細(xì)胞測序時(shí)，最重要的就是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不要等到已經(jīng)做完測序N多錢投了出去，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有問題。如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)無誤，我們基本思路上是準(zhǔn)備找新亞群來看看有沒有什么特異性功能，其實(shí)多數(shù)找出來的所謂的“新亞群”要不是和分裂相關(guān)，要不是和代謝相關(guān)，其實(shí)質(zhì)的重要功能意義基本沒有。（勸大家不要總抱著找新亞群的想法，要去找同一群里的不同細(xì)胞的異質(zhì)性）

這篇文章其實(shí)也是通過模擬腫瘤環(huán)境來找部分分子功能的，我忽然想起了一篇設(shè)計(jì)簡單，但很有趣的文章，大家可以看一看！這篇文章是耶魯大學(xué)吳殿青組在***Developmental Cell***上發(fā)表的文章，題目是 《Leukocyte cytoskeleton polarization is initiated by plasma membrane curvature from cell attachment 》

參考文獻(xiàn)

Ligorio M, Sil S, Malagon-Lopez J, Nieman LT, Misale S, Di Pilato M, Ebright RY, Karabacak MN, Kulkarni AS, Liu A, Vincent Jordan N, Franses JW, Philipp J, Kreuzer J, Desai N, Arora KS, Rajurkar M, Horwitz E, Neyaz A, Tai E, Magnus NKC, Vo KD, Yashaswini CN, Marangoni F, Boukhali M, Fatherree JP, Damon LJ, Xega K, Desai R, Choz M, Bersani F, Langenbucher A, Thapar V, Morris R, Wellner UF,Schilling O, Lawrence MS, Liss AS, Rivera MN, Deshpande V, Benes CH, Maheswaran S, Haber DA, Fernandez-Del-Castillo C, Ferrone CR, Haas W, Aryee MJ, Ting DT.Stromal Microenvironment Shapes the Intratumoral Architecture of Pancreatic Cancer. Cell. 2019 May 23. pii: S0092-8674(19)30510-0. doi:10.1016

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總結(jié)

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