近日，中國農業科學院作物科學研究所夏蘭琴實驗室利用水稻密碼子優化的nCas9 (H840A)蛋白和逆轉錄酶突變體(M-MLV-RT)的融合基因，開發了一種高效的植物引導編輯(Prime Editing)系統，成功精準編輯了水稻的外源hptII突變基因和內源OsEPSPS基因，獲得了精準編輯純合和雜合植株，拓展了植物基因組精準編輯工具。相關研究成果于2020年3月25日在線發表于Molecular Plant雜志上。

https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.03.011

對重要農作物基因組進行定點修飾，包括關鍵基因的定點敲除、等位基因替換以及外源基因的定點整合等，將有助于重要農藝性狀的功能基因鑒定、復雜農藝性狀的調控網絡解析和新種質創制，對加快農作物遺傳改良進程具有重要意義。

近年來，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點編輯、單堿基替換和同源重組體系的建立和利用，在農作物基因功能研究和精準育種中發揮了重要作用，展現了廣闊的發展潛力和應用前景。然而，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點敲除技術只能在基因組特定位點產生隨機插入和刪除。由CRISPR/Cas系統衍生的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，只能在基因組靶向位點實現C→T，G→A，A→G和T→C等4種單堿基轉換，還不能實現其它類型的堿基顛換。通過同源定向修復(HDR)技術，進行基因組精確編輯，在植物中的效率依然非常低，只在少數實驗室可行。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組精準編輯技術體系。

此前，哈佛大學David R. Liu教授研究團隊,通過將Cas9缺刻酶nCas9 (H840A)與逆轉錄酶突變體(Engineered M-MLV-RT)融合，在哺乳動物中開發了一系列新的基因組精準編輯體系-引導編輯系統(prime editors)。該系統能夠在不存在DNA雙鏈斷裂缺口和DNA供體修復模板的情況下，即可實現靶向插入、刪除和所有類型的單堿基自由轉換和顛換，為提高作物精確編輯效率提供了可能。

在引導編輯系統中，引導編輯作用的pegRNA(prime editing guide RNA)，通過在sgRNA骨架的3’端引入引物初始結合位點(Primer binding site，PBS)序列結合nCas9斷裂的非靶標鏈，以pegRNA上攜帶目標突變的逆轉錄本(RT)為模板，通過延申，產生含有目的突變的單鏈DNA。細胞進一步通過DNA損傷修復和復制把目的突變引入基因組。此外，在非編輯鏈上引入能產生缺刻的sgRNA，有助于提高引導編輯的效率。

植物引導編輯系統對外源hptII突變基因和內源EPSPS基因的精準編輯

基于動物引導編輯系統，夏蘭琴實驗室進一步優化該系統，構建了高效植物引導編輯體系。將水稻密碼子優化的逆轉錄酶突變體(Engineered M-MLV-RT)融合在具有雙核定位信號的nCas9(H840A)蛋白的C末端，使用玉米增強型啟動子Ubiquitin啟動子驅動該融合基因表達，并添加了具有增強mRNA穩定性的PolyA結構和豌豆Rubisco小亞基E9終止子終止轉錄和翻譯；進一步，使用水稻組成型Actin啟動子驅動pegRNA和sgRNA的共表達，采用體內可自我剪切的tRNA間隔，同時添加了PolyA結構和Nos終止子以增強轉錄本的穩定性和提高表達量，構建了高效的植物引導編輯系統 (prime editor-basic)。利用上述植物引導編輯系統，通過靶向水稻外源hptII突變基因和內源OsEPSPS基因進行精準基因編輯，T0代成功地獲得了15株hptII精準修飾純合植株和1株OsEPSPS基因精準修飾雜合植株，精確編輯效率分別為9.38%和2.22%。

高效植物引導編輯系統的建立，為水稻以及其他作物基因組精確編輯提供了有效工具，有望大大促進農作物定向遺傳改良的進程。

作科所博士研究生李慧園，李晶瑩和博士后陳繼林為本文共同第一作者，夏蘭琴研究員為本文通訊作者。本研究得到轉基因重大專項和中國農科院創新工程與‘農科英才’特支計劃項目資助。

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總結

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