在講測序原理之前，需要有一些最基本的生物知識了解

1）雖然DNA鏈很長，但是RNA可能比較短，因?yàn)橛行┗蜣D(zhuǎn)錄了，有些基因沒有轉(zhuǎn)錄

2）一個(gè)DNA上有許多基因片段，每個(gè)基因片段的DNA鏈能轉(zhuǎn)錄出一種mRNA，一種mRNA能翻譯出一種蛋白質(zhì)

3）轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA聚合酶一般只轉(zhuǎn)錄一個(gè)基因

4）每個(gè)細(xì)胞內(nèi)RNA可能是不同的，因?yàn)椴煌?xì)胞基因表達(dá)情況不同

對轉(zhuǎn)錄組測序，我們需要對細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組的情況有一定的了解。我們帶著問題去尋找答案

第一：RNA到底測的什么？

mRNA在生物個(gè)體內(nèi) RNA的組分中只占很小的一部分，rRNA占絕大多數(shù)。一般我們說 RNA-seq指的都是mRNA-seq，后面的流程也都是主要針對mRNA-seq數(shù)據(jù)分析的。在科 學(xué)家們的努力下，可以把那些非編碼 RNA提取出來建庫，進(jìn)行測序。 一個(gè)成功的 RNA-seq研究，起決定性因素的是一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。還依賴于建庫的類型、測 序深度和設(shè)置適于的生物重復(fù)。并且盡量減少測序本身以外帶來的數(shù)據(jù)誤差

第二：文庫構(gòu)建

一般生物體中的的 RNA中，rRNA占絕大多數(shù)，含量超過 90%，而mRNA的含量在 1-2%，左右，轉(zhuǎn)錄組測序文庫是以樣本的Total RNA為基礎(chǔ)，從中提取mRNA構(gòu)建測序文庫，因此文庫構(gòu)建包括mRNA富集和碎片化、mRNA反轉(zhuǎn)錄、接頭添加和PCR富集等過程

mRNA富集

在生物的Total RNA中，mRNA所占比例很低，絕大部份時(shí)核糖體RNA (rRNA)，因此如果直接使用Total RNA進(jìn)行測序，得到的結(jié)果必然是不準(zhǔn)確的，因此需要先將Total RNA中的mRNA分類純化出來。

轉(zhuǎn)錄組測序的文庫根據(jù)待測樣品的物種分為真核轉(zhuǎn)錄組和原核轉(zhuǎn)錄組。由于真核生物和原核生物mRNA結(jié)構(gòu)不同，因此在mRNA富集時(shí)所采用的方法也并不相同。

真核生物mRNA中含有polyA尾結(jié)構(gòu)，因此可以使用oligoT與其特異性的匹配，從而在Total RNA中特異性的富集mRNA。

然而，原核生物并不像真核生物mRNA具有polyA的結(jié)構(gòu)，因此，無法直接利用oligoT將mRNA純化出來，目前，提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除Total RNA中rRNA。

由于測序儀器不能直接對RNA測序，所以還要反轉(zhuǎn)錄成cDNA

鏈特異性文庫

由于轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建過程中要將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈的cDNA，因此，在測序時(shí)，即會同時(shí)得到cDNA雙鏈的序列信息，這就消除了mRNA單鏈的特性，無法區(qū)分cDNA中的正義鏈和反義鏈。

因此提出了另一種文庫構(gòu)建方式，鏈特異性文庫，其在文庫制備和測序中保留mRNA 的方向信息，使得有效數(shù)據(jù)增多，基因表達(dá)定量更準(zhǔn)確；基因注釋更準(zhǔn)確，新基因識別等分析更可靠；同該方法能夠鑒定與開放閱讀框反義的ncRNA、發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)錄本。

其建庫原理與普通轉(zhuǎn)錄組類似，不同之處在于合成第二鏈cDNA時(shí)，用dUTP代替dTTP，此時(shí)第二鏈cDNA上布滿了含dUTP的位點(diǎn)。

在接頭連接后用一種特定的酶，其可在尿嘧啶位置產(chǎn)生一個(gè)單核苷酸缺口，從而消化掉第二鏈cDNA，只保留第一鏈cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增純化，得到只含第一鏈cDNA信息的文庫。

總結(jié)

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