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教材?Molecular biology of the?gene?7th edition ?J.D. Watson et. al

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轉(zhuǎn)錄機(jī)制

一、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄周期

1、

• 細(xì)菌：一種轉(zhuǎn)錄酶
• 真核：三種轉(zhuǎn)錄酶（植物+2種）
  • Pol I ? 大核糖體RNA前體
  • Pol II ?幾乎轉(zhuǎn)錄所有蛋白質(zhì)編碼
  • Pol III tRNA，小的核RNA基因，5S人RNA基因
  • （Pol IV、V 植物中，參與轉(zhuǎn)錄小干擾RNA）

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細(xì)菌聚合酶的核心酶可獨(dú)立合成RNA

• 2 * α + β + β'_大亞基?+?ω
• 酶的形狀像個(gè)蟹爪
• 鉗子基部有活性中心裂隙
  • 依靠雙金屬離子催化合成反應(yīng)
  • 位點(diǎn)結(jié)合一個(gè)Mg²⁺
  • 另外一個(gè)離子隨人NTP進(jìn)入隨PPi釋放
• 酶上有多種通道

2、由RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄是由一系列步驟完成的

• initiation
  • promoter 最初結(jié)合RNA聚合酶的序列
• elongation
  • 合成了10個(gè)堿基以后，便進(jìn)入延伸階段
• termination

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3、轉(zhuǎn)錄的起始包含三個(gè)定義明確的步驟

• 閉合復(fù)合體的形成
  • 雙鏈狀態(tài)
  • 聚合酶結(jié)合在一個(gè)面上
• 轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放復(fù)合體
  • 雙鏈在起始位點(diǎn)13bp距離內(nèi)形成轉(zhuǎn)錄泡
  • 此時(shí)復(fù)合體叫：轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體（initial transcribing complex）
  • 最初10bp合成效率相當(dāng)?shù)?#xff0c;會(huì)不斷合成小片段釋放
  • 合成超過(guò)10bp，聚合酶逃離啟動(dòng)子
• 啟動(dòng)子逃離，進(jìn)入轉(zhuǎn)錄起始階段

原核的轉(zhuǎn)錄?

二、細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄周期

1、細(xì)菌的啟動(dòng)子在強(qiáng)度和序列上是多樣的

• 原則上細(xì)菌RNA聚合酶核心酶可以在DNA分子的任意一點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄
  • 但是聚合酶不能打開雙鏈
• 但是在細(xì)胞內(nèi) ，有σ起始因子的參與，聚合酶只在啟動(dòng)子處轉(zhuǎn)錄
• σ + 核心酶 = 全酶（holoenzyme）

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細(xì)菌啟動(dòng)子元件有不同的組合情況

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• 大腸桿菌最常見(jiàn)的σ因子是σ⁷⁰?具有如下特征
  • 兩段6核苷酸長(zhǎng)的保守序列
    
    • -10， -35
  • 被長(zhǎng)度17-19bp的非特異性序列隔開

• 啟動(dòng)的蛋白所識(shí)別的共有序列越相近，啟動(dòng)子越強(qiáng)
  • 單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越多
• 啟動(dòng)子的強(qiáng)度 與以下因素相關(guān)
  • 啟動(dòng)子最初與聚合酶的結(jié)合程度
  • 異構(gòu)化作用的支持效率
  • 此后聚合酶逃離的難易程度
• 這解釋了表達(dá)水平的差異

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• 較強(qiáng)的啟動(dòng)子中（如指導(dǎo)rRNA）有UP-element
  • 提供額外的特異性
• 缺失-35區(qū)的σ⁷⁰擁有上游延長(zhǎng)-10區(qū)，以補(bǔ)償
  • 大腸桿菌gal基因
• -10下游有鑒別子（discriminator）（都有？？）
  • 與聚合酶作用影響穩(wěn)定性

2、σ因子介導(dǎo)聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（形成閉合復(fù)合體）

• • σ⁷⁰ 有4個(gè)結(jié)構(gòu)域

• -35 被區(qū)域4的兩個(gè)螺旋形成 helix-turn-helix識(shí)別
• 一個(gè)插入-35 大溝，與堿基作用
• 另一個(gè)從大溝頂部橫穿過(guò)，與骨架接觸
• 與-35的結(jié)合提供能量確保聚合酶-啟動(dòng)子結(jié)合
• 這一種motif結(jié)構(gòu)見(jiàn)于很多DNA結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)錄激活、抑制因子）

• -10 被區(qū)域2α螺旋識(shí)別
  • 螺旋包含幾個(gè)芳香氨基酸
  • 可以與非模板鏈相互作用維持解旋DNA的穩(wěn)定（類似SSB）

• • 區(qū)域2結(jié)合一個(gè)單鏈狀態(tài)的-10element
  • 非模板鏈鏈上的兩個(gè)堿基插入σ的口袋中

• ?-10 的延長(zhǎng)序列被結(jié)構(gòu)域3識(shí)別
  
• 鑒別子由結(jié)構(gòu)域1、2識(shí)別
• UP-element 不被 σ 識(shí)別，被α亞基羧基端αCTD識(shí)別
• 區(qū)域3.2被稱為3/4連接區(qū)

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3、向開放式復(fù)合體的轉(zhuǎn)變涉及RNA聚合酶和啟動(dòng)子DNA的結(jié)構(gòu)變化

　　異構(gòu)化作用（isomerization）

• 異構(gòu)化作用不需ATP?，依靠?jī)?yōu)勢(shì)構(gòu)相驅(qū)動(dòng)
• 異構(gòu)化不可逆，開放式復(fù)合體形成后，轉(zhuǎn)錄隨后起始
  • 相反，閉合式復(fù)合體的形成是可逆的?

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• ?在活性中心內(nèi)，DNA從+3位置開始分離
• 聚合酶后的上游DNA在-11位置重新恢復(fù)雙鏈 σ因子 N 端（1.1）起到分子模擬物（molecular mimic）的作用（+電）
  • 結(jié)合DNA前，是1.1結(jié)合在活性中心

?4、轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶起始，不需要引物

• ?聚合酶需與一條或多條DNA模板鏈，起始核苷酸以及第二個(gè)核苷酸建立特異性作用
  • 嚴(yán)格控制方向
• 大多數(shù)轉(zhuǎn)錄物以同一核苷酸開始
• σ的3/4linker 與模板鏈互作，，確保正確位置和構(gòu)象啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄

5、轉(zhuǎn)錄的起始階段RNA聚合酶保持位置不變，并將下游DNA拉向自己

• 三種模型
  • 瞬時(shí)漂移
  • 蠕蟲移動(dòng)
  • 蜷縮

• 單分子實(shí)驗(yàn)（FRET）支持蜷縮模型
  • 聚合酶下游的DNA被酶拉進(jìn)來(lái)，在內(nèi)部形成泡結(jié)構(gòu)

6、啟動(dòng)子的逃離涉及聚合酶-啟動(dòng)子相互作用 以及

　　聚合酶核心-σ相互作用的破壞

• 一旦合成長(zhǎng)度達(dá)到10bp，轉(zhuǎn)錄物變要穿入酶的RNA出口通道
• σ3/4作為分子模擬物占據(jù)RNA出口通道
• 合成達(dá)到10bp，RNA鏈便將σ3/4逐出
• σ也常常會(huì)從延長(zhǎng)酶上丟失
• 逃離后，轉(zhuǎn)錄泡從22-24bp縮小為12-14bp
  • 這會(huì)釋放能量，讓聚合酶離開啟動(dòng)子并驅(qū)逐σ因子

?有些生物如大腸桿菌噬菌體T7是單亞基聚合酶，沒(méi)有σ因子，但也有類似的結(jié)構(gòu)變化以讓合成超過(guò)10bp的RNA穿出RNA通道

7、延伸聚合酶是一個(gè)邊合成邊校對(duì)的機(jī)器

• ?增長(zhǎng)中的RNA有8-9個(gè)堿基與DNA保持互補(bǔ)
• 聚合酶每前進(jìn)相當(dāng)于單核苷酸長(zhǎng)度的一步，3'端添加一個(gè)核苷酸
• 轉(zhuǎn)錄泡的大小不變

轉(zhuǎn)錄酶的校對(duì)機(jī)制（proofreading）

• 焦磷酸編輯 pyrophosphorolytic editing
  • 是rNTP合成的逆反應(yīng)
  • 錯(cuò)配導(dǎo)致合成速度減慢（空間位點(diǎn)不正確）
  • 聚合酶利用空間結(jié)構(gòu)特性短暫限制PPi的離開
  • PPi + RNA_n = RNA_n-1?+ rNTP
• 水解編輯 hydrolytic editing

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  • 聚合酶倒退入rNTP進(jìn)入通道（利用環(huán)境中的熱,0°C不發(fā)生，37°C發(fā)生）
  • Gre因子（E.coli）、TFIIS（真核）進(jìn)入
  • 水解

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8、聚合酶可能會(huì)因?yàn)槟０鍝p傷停滯不前，需要被挪走

　　TRCF挪走停滯的聚合酶，并且招募修復(fù)酶

• TRCF結(jié)合上游雙鏈（依靠ATP），并且尋找到停滯的RNA聚合酶
• 推動(dòng)聚合酶向前合成，或者令三重復(fù)合體解離
• 招募轉(zhuǎn)錄藕聯(lián)修復(fù)酶（UvrA、B、C）

9、轉(zhuǎn)錄由RNA序列內(nèi)部信號(hào)停止

• Rho依賴型
  • Rho（ATP依賴）從rut位點(diǎn)結(jié)合單鏈
  • 尋找聚合酶
  • 將RNA扯出，或像TRCF一樣作用

Rho的結(jié)合有特異性：

• Rut位點(diǎn)理想：40bp，不折疊為二級(jí)結(jié)構(gòu)，富含C
• 不結(jié)合正在翻譯的RNA
  • 故在細(xì)菌中，是等轉(zhuǎn)錄超過(guò)一個(gè)基因（編碼序列）后才終止的

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最近研究顯示Rho因子是通過(guò)轉(zhuǎn)錄循環(huán)早期與RNA聚合酶結(jié)合

隨著轉(zhuǎn)錄易位

易位導(dǎo)致緊繃

到一定程度，將酶終止

• Rho非依賴型

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  • 非依賴型終止子也稱固有終止子（intrinsic terminator）
  • 組成
    • 反向重復(fù)序列
    • 8個(gè)U
  • 形成發(fā)夾，引發(fā)相關(guān)信號(hào)，轉(zhuǎn)錄物脫離

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真核的轉(zhuǎn)錄

三、真核生物的轉(zhuǎn)錄

• 真核生物的轉(zhuǎn)錄除了需要聚合酶外，還需要通用轉(zhuǎn)錄因子General transcription factor，GTF
• 在體內(nèi)，由于有核小體，轉(zhuǎn)錄還需要
  • DNA結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白
  • 中介蛋白復(fù)合體
  • 染色質(zhì)修飾酶

1、RNA聚合酶II的核心啟動(dòng)子由4個(gè)不同序列的元件構(gòu)成

• TFIIB識(shí)別元件
• TATA元件
• 起始子（Inr）
• 下游啟動(dòng)子元件（包括DPE、DCE、MTE）

　　核心啟動(dòng)子之外，存在的在體內(nèi)進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄所需的其他序列元件。共同組成調(diào)節(jié)序列

• 啟動(dòng)子最近元件（promoter proximal element）
• 上游激活物序列（upstream activator sequence，UAS）
• 增強(qiáng)子
• 沉默著子
• 邊界元件
• 絕緣子

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?2、RNA聚合酶II在啟動(dòng)子上和通用轉(zhuǎn)錄因子形成前起始復(fù)合物

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• ?TFIID由TBP（TATA Binding Protein)與TAF(TBP Associated Factor)組成
• TFIID 的TBP 識(shí)別TATA box
• 真核的啟動(dòng)子解旋需要TFIID的ATP水解介導(dǎo)
• 還需要聚合酶CTD磷酸化

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3、啟動(dòng)子的逃離需要聚合酶的尾巴磷酸化

• Pol II 的CTD由連續(xù)重復(fù)7肽序列
  • Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
  • 每個(gè)重復(fù)序列都有激酶磷酸化位點(diǎn)
  • TFIIH的一個(gè)亞基由激酶功能

4、TBP用插入雙螺旋小溝的β折疊來(lái)結(jié)合并扭曲DNA

• 結(jié)合的特異性來(lái)自插入到識(shí)別序列兩端的堿基對(duì)，這由驅(qū)動(dòng)DNA發(fā)生強(qiáng)烈彎曲的兩對(duì)苯丙氨酸的側(cè)鏈實(shí)現(xiàn)

5、其他通用轉(zhuǎn)錄因子在起始中也有特殊作用

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6、體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄需要其他蛋白的參與，包括中介蛋白復(fù)合體

聚合酶的CTD尾巴結(jié)合有mediator，它有助于聚合酶分子定位到啟動(dòng)子

• mediator的一個(gè)表面結(jié)合Pol II CTD尾巴
• mediator另外的表面結(jié)合其他起始因子
• 如果缺失中介蛋白，常會(huì)導(dǎo)致一些基因失去表達(dá)
• 中介蛋白把聚合酶定位到不同的啟動(dòng)子上

• 在TFIIH水解ATP的介導(dǎo)下，雙鏈打開，轉(zhuǎn)錄起始
• 加帽酶5’端加帽

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7、一組新的因子激發(fā)Pol II 延伸 和RNA校對(duì)（proofreading）

• NELF ：負(fù)延伸因子
• DSIF ：DRB敏感因子?
• 它們抑制早期轉(zhuǎn)錄，使得轉(zhuǎn)錄在+25 ~ +60處停止
• P-TEFb會(huì)使得重新開始轉(zhuǎn)錄

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8、聚合酶延伸過(guò)程中對(duì)抗組蛋白的阻礙

• FACT 通過(guò)暫時(shí)挪開一個(gè)H2A·H2B二聚體方便轉(zhuǎn)錄

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9、延伸聚合酶與各種RNA加工所需的一組新蛋白質(zhì)相互作用??

• 5'端加帽
• 轉(zhuǎn)錄poly-A信號(hào)
• 相關(guān)蛋白募集
  • CSTF
  • CPSF
• 切割
• 多聚腺苷酸化
• 終止
  • 魚雷模型較受認(rèn)可
  • Rat快速消化正在合成的5'沒(méi)有帽的RNA
  • 達(dá)到聚合酶時(shí)，將RNA鏈扯出消化

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?四、由聚合酶I和聚合酶III催化的轉(zhuǎn)錄

1、聚合酶I 聚合酶III識(shí)別不同的啟動(dòng)子，但仍需TBP

2、Pol I 只用于轉(zhuǎn)錄RRNA基因

• UBF結(jié)合UCE
• 引入SL1（由TBP與TAF組成)
• 募集Pol I 至核心啟動(dòng)子，激發(fā)轉(zhuǎn)錄

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3、Pol III 的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游

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轉(zhuǎn)載于:https://www.cnblogs.com/lokwongho/p/9794930.html

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的MIT Molecular Biology 笔记5 转录机制的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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