無選擇性標記基因技術可分為兩大類:一類是去除選擇性標記基因的方法,這類方法大至有4種:一種是共轉化法,這種方法是將功能基因和篩選基因構建到不同的載體或是同一載體的不同位點上,然后同時轉化受體細胞,最后可以獲得兩個基因共整合的轉化植株,其中一部分轉化植株的這兩個基因并不連鎖,鑒定后通過后代的有性分離可獲得只轉入功能基因的植株,最終達到刪除選擇性標記基因的目的。第二種是位點特異性重組,它是由重組酶和它的識別位點組成,識別位點正向排列時,重組酶就可以專一地催化這兩個識別位點,最終導致它們之間的所有基因序列被切除,實現重組。位點特異性重組系統包括Cre/lox系統、FLP/FRT系統、R-RS系統等。Dale等首次將Cre/loxP系統用于轉基因煙草,成功地剔除了hpt標記基因。在煙草中的研究發現,FLP/FRT系統重組刪除效率在19%~47%。因此,Flp/frt系統在植物中應用的情況遠不如Cre/lox系統。近幾年這兩個系統在白楊中也進行了廣泛研究并取得了一定成果。第三種是轉座子介導的再定位法,例如玉米的Ac/DS轉座系統,Yoder等和Goldsbrough等利用這種方法轉化成功,報道表明了這個系統能夠使目的基因進行再定位,從而產生無標記基因植株。第四種是同源重組法,它是將重復序列之間插入標記基因,重復序列進行同源重組來切除標記基因,重復序列可以是基因表達框的任何部分,Zubko等的研究表明這種方法可獲得無標記基因的植株。這一類的共同點都是將選擇標記基因和目的基因整合到不連鎖的位點上,雜交篩選后去除標記基因。另一類是無標記基因直接轉化法,主要利用基因槍法和花粉管通道法進行轉化,轉化的基因只含有啟動子、目的基因和終止子序列,首次是用基因槍法在水稻上轉化成功的,在小麥、馬鈴薯等作物中也得到應用。用花粉管通道法也成功地應用到大豆和玉米。

總結

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