TGN/EE介導的囊泡運輸與GDI1協同調控根毛中ROP2 GTPase的動態定位的機理研究

【摘要】：根毛是根表皮細胞凸起形成的管狀結構,是植物吸收水分和無機鹽的主要部位,其形態的維持對植物的生長發育及響應外界脅迫具有重要意義。由于根毛培養周期較短,便于細胞學觀察,與病原菌存在互作關系,并且是快速生長的極性細胞,而成為優良的研究系統。在此我們以根毛為研究體系,探索小G蛋白ROPs (Rho-related GTPases from plant)極性定位的調控機制。已有研究表明植物細胞極性生長的維持依賴于活性ROPs的時空特異性定位。ROPs是植物中一類重要的小G蛋白,在植物生長發育、激素信號轉導、抗逆和抗病過程中起重要的調控作用。ROPs具有“分子開關”的作用,分為GTP結合的活性形式和GDP結合的非活性形式,調控其形式轉變的作用因子分為三類,鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins, GAPs)和鳥苷酸解離抑制因子(guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs)。其中GEF和GAP調控機理的研究相對清晰,GEF使非活性形式的ROPs轉化為活性形式的ROPs,而GAP使活性形式的ROPs轉化為非活性形式。目前關于GDI調控ROP的機制研究并不是很清晰,且主要集中于GDI從質膜上移除ROP進入胞質的負調控作用。然而,利用動物以及酵母系統進行的研究表明,GDI除了這種負調控外,還負責將Rho從內質網膜轉運到質膜上,即對其定位具有正調控作用。植物中的GDI是否有類似的功能還不清楚。此外,動物及酵母Rho靶向質膜的途徑除了GDI參與外,還通過特定的囊泡運輸途徑介導。這一方面在植物細胞系統中還尚未有報道。本研究旨在揭示GDI及囊泡運輸對根毛中重要的小G蛋白ROP2動態定位的調控作用。研究結果和主要結論如下：(1)根毛中GD11調控ROP2的頂端質膜定位GD1l功能缺失突變體scnl-1根毛中ROP2的頂端極性定位發生紊亂,造成根毛的多個起始。我們利用CITRINE-TUBBY-C標記scnl-1突變體中phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate (PIP2)的定位,結果發現在scn1-1突變體根毛中確實存在多個PIP2聚集的生長點,并且PIP2在根毛頂端的分布范圍擴大,暗示GDIl功能喪失干擾了單一頂端的形成和維持。為了研究GDI1是否介導ROP2靶向質膜的過程,我們通過熒光漂白恢復實驗(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)對野生型和scnl-1突變體根毛頂端質膜上GFP-ROP的定位進行研究,在野生型根毛頂端質膜上的GFP-ROP被漂白后能夠快速恢復,在scnl-1突變體中GFP-ROP的恢復速度明顯慢于野生型。說明GDI1對于ROP2靶向質膜的過程具有關鍵作用。(2)反式高爾基網絡(TGN/EE, trans-Golgi network/early endosomes)介導的囊泡運輸參與調控ROP2的動態定位。為了探究ROP在根毛頂端質膜的極性定位是否還依賴于囊泡運輸途徑的調控,我們結合遺傳學和藥劑學的手段,阻斷特定的囊泡運輸途徑,分析ROP的動態定位。我們的結果表明ROP2的動態定位依賴于ARF1 (ADP-ribosylation factorl),布雷菲德菌素A(brefeldin A, BFA)敏感的高爾基后囊泡運輸途徑。高爾基后囊泡運輸途徑又分為兩條,包括銜接蛋白API (Adaptin Protein 1)介導的在TGN/EE上進行的外排途徑和RabA4b介導的外排途徑。我們進一步的研究結果表明AP1介導的TGN/EE上的外排途徑參與ROP靶向質膜的過程。并且ROP2的動態定位不依賴于RAB5調控的液泡降解途徑。(3) FRAP實驗表明GDI1和囊泡運輸共同調控ROP2頂端質膜的動態定位我們利用BFA處理及ARF1-DN (dominant-negative)干擾外排運輸途徑,發現在根毛頂端質膜定位的GFP-ROP2漂白后恢復速度與野生型的恢復速度沒有明顯區別。但是將ARF1-DN通過雜交引入到scnl-1突變體或用BFA處理scnl-1突變體,與Scnl-1突變體相比GFP-ROP2漂白后的恢復速度顯著降低了,暗示GDI1對ROP2的頂端質膜定位具有關鍵的調控作用,而囊泡運輸同樣參與調控ROP2的動態定位。結論：GDI1和囊泡運輸協調控制根毛的極性生長。我們發現GDI1對ROP2在根毛極性生長過程中的動態定位具有快速調控的作用,且控制根毛單一極性生長點的建立與維持。而囊泡運輸途徑受到GDI1途徑的影響,主要在根毛的快速生長中起調控作用。這些結果證明GDI1與TGN/EE介導的囊泡運輸這兩條途徑決定了ROP在根毛極性生長過程中動態的頂端定位,以保證根毛的極性建立、極性維持和快速生長。

總結

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