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基于DNA宏條形碼的水體微型真核生物群落測序建庫方法

Library construction for DNA metabarcoding of microeukaryotic communities in waters

莫媛媛^{1, 2}，馬國琳^{1, 3}，薛媛媛¹，楊軍^1*

¹水生態(tài)健康研究組，城市環(huán)境與健康重點實驗室，福建省流域生態(tài)重點實驗室，中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，廈門，福建；²中國科學(xué)院大學(xué)，北京; ³福建農(nóng)林大學(xué)，福州，福建

*通訊作者郵箱: jyang@iue.ac.cn

摘要：微型真核生物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有極高的物種多樣性，在生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。高通量測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用有助于我們對微型真核生物的研究和認(rèn)知。為了研究水體微型真核生物多樣性和群落特征，我們可以從水體環(huán)境 (海洋、河流、湖泊、水庫等) 中采集樣品，提取樣品總DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建及相關(guān)檢測。首先以總DNA為模板，選擇合適的標(biāo)記基因 (主要是18S rRNA基因的片段) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物通過電泳、膠回收得到純化的目的DNA片段，并測定DNA濃度，最后按照等質(zhì)量方式進(jìn)行混樣，通常30份樣品混為1個庫，檢測合格的文庫采用高通量測序平臺 (如Illumina HiSeq) 進(jìn)行測序。

關(guān)鍵詞：微型真核生物，DNA條形碼，環(huán)境DNA，建庫方法，高通量

材料與試劑

1.聚碳酸酯濾膜 (Millipore, TSTP04700/ GTTP04700)

2.DNA提取試劑盒 (MP Biomedicals, FastDNA Spin Kit)

3.高保真PCR酶試劑 (New England Biolabs, Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)

4.18S rRNA基因通用引物，例如：1) V9可變區(qū)引物 1380F (5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′) 和引物1510R (5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′)；2) V4可變區(qū)引物547F (5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3′) 和引物967R (5′-ACTTTCGTTCTTGAT-3′) 或 引物Ek-NSF573F (5′-CGCGGTAATTCCAGCTCCA-3′) 和引物Ek-NSR951R (5′-TTGGYRAATGCTTTCGC-3′)

5.96孔板和封板膜 (Roche, LightCycler 480 Multiwell Plate 96)

6.上樣緩沖液Loading buffer (Takara, 6×Loading Buffer, Cat. No. 9156)

7.瓊脂糖粉末 (Sigma, A9539-250G)

8.Tris-乙酸鹽-EDTA緩沖液 (Solarbio, 50×TAE)

9.DNA標(biāo)記 (DNA Marker) (New England Biolabs, 50bp DNA Ladder, NEB #B7025)

10.凝膠純化試劑盒 (南京諾唯贊, DC301-01)

11.Qubit分子定量試劑盒 (Promega, QuantiFlour dsDNA System)

儀器設(shè)備

1.200 μm尼龍篩絹 (紹興華豐, 80目)

2.過濾裝置及配套玻璃濾杯、濾芯 (天津津騰, JTFA0214)

3.真空泵 (上海亞榮, SHZ-III)

4.高壓滅菌鍋 (TOMY, Sx-500)

5.5 L量杯

6.500 mL量筒

7.超低溫冰箱 (Thermo, ULT1386-5v)

8.移液器 (Eppendorf, 100–1000 μL, 10–100 μL 20–200 μL, 2–20 μL, 0.5–10 μL, 0.1–2.5 μL)

9.超凈工作臺 (蘇凈安泰, Airtech)

10.均質(zhì)儀 (杭州奧盛, Bioprep-24)

11.離心機(jī) (Eppendorf, 5417R)

12.超微量紫外分光光度計 (NanoDrop ND-1000)

13.干式加熱器 (Labnet, D1100-230V)

14.旋渦混合器 (海門其林貝爾, Vortex-6)

15.200 μL八聯(lián)移液器 (Brand, 10-200 μL)

16.96孔板離心機(jī) (杭州奧盛, Mini-P25)

17.PCR熱循環(huán)儀 (Bio-Rad, S1000)

18.電泳儀 (北京六一, DYY6C)

19.電泳槽 (北京六一, JYCP31DN)

20.凝膠成像儀 (上海培清, JS-680B)

21.核酸測定儀 (ThermoFisher, Qubit 4.0)

22.其他 (聚乙烯塑料桶、鋁箔紙、移液器吸頭、離心管、剪刀、鑷子、酒精燈、燒杯)

實驗步驟

1.樣品采集、過濾與保存

1.1樣點設(shè)置及采樣

依據(jù)研究目的布設(shè)采樣站位，水深大于10 m的水體應(yīng)考慮分層采樣。首先使用原位水樣潤洗3次聚乙烯塑料桶，每個樣點至少采集10 L水樣，并灌裝至預(yù)先寫好樣品編號的聚乙烯塑料桶。采集的水樣在1 h內(nèi)運(yùn)回實驗室進(jìn)行處理。

1.2過濾

1)過濾前準(zhǔn)備：將保存樣品的2 mL離心管置于高壓滅菌鍋滅菌 (121 °C，30 min) 后，使用烘箱 (60 °C) 徹底烘干；用超純水清洗干凈濾杯、濾芯、量杯、量筒和抽濾瓶。

2)安裝過濾裝置：組裝好過濾裝置、抽濾瓶和真空泵，使用滅菌后鑷子將孔徑為0.22 μm的聚碳酸酯濾膜 (直徑47 mm，Millipore，美國) 置于濾芯之上，用配套濾杯壓住濾膜邊緣后再用配套夾子夾緊固定濾杯，確保濾杯與濾芯接觸面連接良好、不漏水，啟動真空泵，負(fù)壓為0.02 Mpa。

3)過濾水樣：將聚乙烯塑料桶中的原水上下?lián)u勻，并用原水潤洗量杯和量筒后，使用200 μm尼龍篩絹過濾至量杯，接著用量筒少量、多次形式添加水樣到濾杯，一般每次加樣50–400 mL，過濾總時間至少為30 min，每次更換不同樣品的水樣進(jìn)行過濾前必須重新用超純水清洗濾杯、濾芯、量杯和量筒，再用待過濾樣品的原水潤洗，避免樣品之間出現(xiàn)交叉污染。

1.3樣品保存

過濾完成后，將載有微型真核生物的濾膜放在尺寸適宜的鋁箔紙上，并對折保存至已滅菌的 2 mL離心管，置于–80 °C的冰箱。

2.水體樣品DNA提取

2.1剪膜

1)準(zhǔn)備實驗工具并置于無菌操作臺內(nèi)，例如剪刀、鑷子、酒精燈、裝有濃度為75%酒精的洗瓶、一次性手套、鋁箔紙、廢品缸。打開紫外燈滅菌15 min。

注：滅菌時，勿將樣品放入操作臺內(nèi)，因為紫外光會破壞DNA從而影響后續(xù)實驗。

2)滅菌完成后，打開玻璃窗，打開吹風(fēng)按鈕，以去除臭氧。

注：玻璃窗口不可打開過大，以免空氣進(jìn)入污染操作臺。

3)從超低溫冰箱取出樣品，核對樣品編號后移入超凈工作臺，用75%酒精消毒雙手 (戴手套)。

4)點燃酒精燈，灼燒鑷子和剪刀，晾涼備用。

注：噴灑酒精進(jìn)行清潔、消毒操作，必須在酒精燈未點燃的情況下進(jìn)行。

5)用鑷子將離心管中載有微型真核生物的濾膜樣品取出并使用剪刀將其剪碎，裝入DNA提取試劑盒專用的裂解管E (Lysing Matrix E) 中，并寫上對應(yīng)的編號。

6)灼燒鑷子和剪刀，重復(fù)上述過程，進(jìn)行下一份樣品濾膜處理。

7)剪膜完成后按編號順序暫置于冰箱–20 °C保存，以備后續(xù)DNA提取。

2.2DNA提取：根據(jù)實驗需求，選擇合適的DNA提取試劑盒，以試劑盒FastDNA Spin Kit (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA) 為例。根據(jù)試劑盒的說明書按步驟提取水體微型真核生物DNA，具體操作步驟如下：

1)在已滅菌的超凈工作臺中將978 μL 磷酸鈉緩沖液 (Sodium Phosphate Buffer) 和122 μL MT緩沖液 (MT Buffer) 加入至裂解管E中；

2)利用均質(zhì)儀震蕩混勻，時間40 s，轉(zhuǎn)速6 m/s；

3)將裂解管E中的樣品進(jìn)行14000 g離心10 min；

4)將裂解管E中上清液完全轉(zhuǎn)移至新的2 mL滅菌離心管中，然后加入250 μL PPS溶液，手動上下顛倒10次混勻；

5)14000 g離心5 min至形成沉淀，將上清液完全轉(zhuǎn)移至新的5 mL滅菌離心管中，同時加入1 mL 結(jié)合基質(zhì)懸浮液 (Binding Matrix Suspension)。注：結(jié)合基質(zhì)懸浮液使用過程中應(yīng)確保充分地上下混勻。

6)手動上下翻轉(zhuǎn)2 min，使DNA附著在基質(zhì)上，將離心管水平地于架子上靜置3 min。

7)小心去除500 μL上清液，用移液器吸打混勻剩余的部分，轉(zhuǎn)移大約600 μL的混合液到吸附柱中，14000 g離心1 min，倒出收集管中的液體。重復(fù)上述過程直至剩余的混合液全部轉(zhuǎn)移完。

8)加入500 μL SWWS-M溶液到吸附柱中，14000 g離心1 min，倒出收集管中的液體，再用14000 g離心2 min，去除基質(zhì)中的SWWS-M溶液。

9)將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，室溫下風(fēng)干5 min。

10)加入60 μL無核酸酶/無熱原的超純水 (DNase/Pyrogen-free water)，用移液器的吸頭輕輕攪動或者用手指輕彈，使沉淀混合后，放入金屬浴中55 °C加熱5 min。

11)14000 g離心2 min，將DNA轉(zhuǎn)移到新的收集管中。

2.3DNA濃度測定及保存

提取的DNA樣品濃度用超微量紫外分光光度計測定，一般要求濃度不低于10 ng/μL。OD260 nm/OD280 nm值應(yīng)在1.7–1.9范圍內(nèi)，表示DNA純度較高，數(shù)值過低表明蛋白質(zhì)含量較多、過高表明樣品中含有RNA。最后將DNA樣品置于?20 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

3.PCR擴(kuò)增

3.1PCR的反應(yīng)體系根據(jù)PCR高保真酶說明書配置。PCR反應(yīng)條件主要取決于實驗過程中使用的引物長度、Taq酶、引物退火溫度和DNA模板濃度。每份樣品必須進(jìn)行3次重復(fù)的PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE質(zhì)量百分濃度為2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物。具體步驟如下：

1)將每個庫 (一般包括30份樣品) 進(jìn)行編號，并做好實驗記錄。

2)選擇18S rRNA基因通用引物，本文以真核生物核糖體小亞基DNA序列的V9可變區(qū)引物1380F (5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′) 和1510R (5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′) 為例進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (Amaral-Zettler等.，2009)。為了區(qū)別每個庫中的30份樣品，需合成6條攜帶不同barcode的1380F和6條攜帶不同barcode的1510R，并分別連接于引物的5′ 端，最后可兩兩配對得到36對不同的引物對。存放于?40 °C冰箱保存。Barcode詳細(xì)信息可參考如下表1。

表1. 微型真核生物群落建庫中所用的引物序列信息，以18S rRNA基因V9區(qū)為例

引物名稱	Barcode序列	引物序列
1380F_B1	CGATGT	CCCTGCCHTTTGTACACAC
1380F_B2	ATCACG	CCCTGCCHTTTGTACACAC
1380F_B3	TGACCA	CCCTGCCHTTTGTACACAC
1380F_B4	ACAGTG	CCCTGCCHTTTGTACACAC
1380F_B5	GCCAAT	CCCTGCCHTTTGTACACAC
1380F_B6	TTAGGC	CCCTGCCHTTTGTACACAC
1510R_B1	ACTGAG	CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
1510R_B2	AGTAGA	CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
1510R_B3	CAACGT	CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
1510R_B4	GAGATT	CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
1510R_B5	GTCTAT	CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
1510R_B6	GTCTCG	CCTTCYGCAGGTTCACCTAC

3)將存放于?40 °C冰箱的PCR引物取出，置于離心機(jī)進(jìn)行離心，條件為14000 g離心3 min。在已滅菌的超凈工作臺中，用無菌去離子水稀釋正向、反向引物至10 μM/μL濃度，并將正反引物分別用移液器取出20?30 μL (視實驗需求而定) 混于1.5 mL無菌離心管中，標(biāo)上編號，最后移至離心機(jī)中進(jìn)行短暫離心使正反引物混勻。需注意的是，此操作僅混前30對引物，后6對引物 (灰色字體) 為備用 (詳見表2)。

表2. 不同組合引物對的編號

引物對編號	引物組合	引物對編號	引物組合
18S1	1380F_B1+1510R_B1	18S19	1380F_B4+1510R_B1
18S2	1380F_B1+1510R_B2	18S20	1380F_B4+1510R_B2
18S3	1380F_B1+1510R_B3	18S21	1380F_B4+1510R_B3
18S4	1380F_B1+1510R_B4	18S22	1380F_B4+1510R_B4
18S5	1380F_B1+1510R_B5	18S23	1380F_B4+1510R_B5
18S6	1380F_B1+1510R_B6	18S24	1380F_B4+1510R_B6
18S7	1380F_B2+1510R_B1	18S25	1380F_B5+1510R_B1
18S8	1380F_B2+1510R_B2	18S26	1380F_B5+1510R_B2
18S9	1380F_B2+1510R_B3	18S27	1380F_B5+1510R_B3
18S10	1380F_B2+1510R_B4	18S28	1380F_B5+1510R_B4
18S11	1380F_B2+1510R_B5	18S29	1380F_B5+1510R_B5
18S12	1380F_B2+1510R_B6	18S30	1380F_B5+1510R_B6
18S13	1380F_B3+1510R_B1	18S31	1380F_B6+1510R_B1
18S14	1380F_B3+1510R_B2	18S32	1380F_B6+1510R_B2
18S15	1380F_B3+1510R_B3	18S33	1380F_B6+1510R_B3
18S16	1380F_B3+1510R_B4	18S34	1380F_B6+1510R_B4
18S17	1380F_B3+1510R_B5	18S35	1380F_B6+1510R_B5
18S18	1380F_B3+1510R_B6	18S36	1380F_B6+1510R_B6

4)根據(jù)實際樣品數(shù) (每個庫30份樣品)，在超凈工作臺中配制適宜的PCR反應(yīng)試劑，基于PCR高保真酶說明書，加入適量濃度為1.25U/25μL酶、2 mM/μL Mg²⁺緩沖液、0.2 mM/μL dNTP、無菌去離子水于已滅菌的2 mL離心管中配制反應(yīng)體系，切記勿加入引物和DNA模板。

5)在滅菌超凈工作臺中，將無菌96孔PCR板置于冰盒上，接著分別將54 μL反應(yīng)試劑加至第1列、第4列、第7列和第10列的每個板孔中。之后分別將混合好的30對引物加入第1列、第4列、第7列和第10列的每個孔中，每個引物對加入3 μL，具體布板見圖1。接著分別將DNA模板加入第1列、第4列、第7列和第10列的每個板孔中，每個DNA模板加入3 μL。其中NG為陰性對照，從所有引物對中任選6對，每個NG孔中分別加入1 μL，并在實驗記錄本上做好記錄，以便后續(xù)PCR時更換其他引物對。

圖1. 30對引物對布板圖 (數(shù)字序號1－30代表第1到第30組混合引物)

6)使用200 μL八聯(lián)移液器，量程設(shè)為50 μL，調(diào)至“mix”模式，分別對96孔板中第1列、第4列、第7列和第10列進(jìn)行吸打、混勻至少10次后，吸取20 μL反應(yīng)體系到第2–3列、第5–6列、第8–9列和第11–12列，并貼上96孔板封板膜，用硬卡片將封板膜與96孔板緊貼，移至96孔板離心機(jī)離心5 min。

7)轉(zhuǎn)至PCR熱循環(huán)儀 (提前開機(jī)) 中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。可參考本文PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性98 °C，1 min；30個循環(huán)為98 °C變性10 s、50 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；最后72 °C延伸5 min。

4.電泳

4.1首先配置1X TAE溶液，接著使用1X TAE溶液和瓊脂糖粉末，配置2%質(zhì)量百分濃度的瓊脂糖凝膠于燒杯中。將燒杯放入微波爐中，中火加熱9–12 min，瓊脂糖完全溶化后立刻加入10 μL電泳染料，并輕輕搖動混勻，倒入制膠板，切勿產(chǎn)生氣泡。最后，將其在常溫下靜置約60 min, 確保完全凝固。

4.2待PCR擴(kuò)增完成后，將96孔板置于96孔板離心機(jī)離心5 min后，去除封板膜。使用200 μL八聯(lián)移液器，分別將第2–3列、第5–6列、第8–9列和第11–12列的樣品分別轉(zhuǎn)移至第1列、第4列、第7列和第10列板孔中。

4.3分別將10 μL的上樣緩沖液（loading buffer）染料加至96孔板第1列、第4列、第7列和第10列中，并混合均勻。其中6個陰性對照孔中分別加入4 μL的上樣緩沖液，并混合均勻。注意，這一操作過程需避光。

4.4將制作的瓊脂糖凝膠放置于裝有1X TAE溶液的電泳槽中，并確保凝膠完全浸泡于溶液中。用100 μL移液器將PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，每一排第一個或者最后一個孔加入10 μL的DNA標(biāo)記 (DNA Marker)。接著6個陰性對照應(yīng)分別加入6個凝膠孔中。設(shè)置條件為80 V、100 mA電泳 30 min。

4.5將完成電泳的凝膠放置于凝膠成像儀中，打開電源，并適當(dāng)調(diào)整光圈和焦距以及凝膠的位置，觀察6個陰性對照是否存在條帶，若其中一個陰性對照樣本出現(xiàn)清晰條帶，則必須重新對全體樣品進(jìn)行PCR實驗。反之，如果陰性對照沒有發(fā)現(xiàn)條帶，再以DNA標(biāo)記為參照，觀察30份樣品的PCR產(chǎn)物是否有目標(biāo)條帶，若出現(xiàn)單一且清晰的目標(biāo)條帶，則PCR實驗成功；若出現(xiàn)無條帶或有雜帶的樣品，這些樣品需要重新進(jìn)行PCR。

5.純化PCR目標(biāo)條帶

5.1提前準(zhǔn)備2 mL無菌離心管、并寫上樣品編號，接著用75%酒精擦拭切膠刀片，在凝膠成像儀中將全部樣品 (30份) 的目標(biāo)條帶逐一切下來，盡量將全部能看見的亮帶都切下來，減少人為操作上的誤差。逐一放入30個2 mL無菌離心管。

5.2根據(jù)純化試劑盒說明書中的步驟，逐步完成。將純化后的DNA裝于1.5 mL滅菌離心管，并直接進(jìn)行后續(xù)實驗或者存放于?80 ^oC冰箱中。

6.純化DNA濃度測定及混庫

6.1基于Qubit分子定量試劑盒說明書中的步驟，每份樣品配置染料200 μL。

6.2準(zhǔn)備650 μL的離心管，并在管蓋和管壁上寫清楚樣品信息，將配制好的200 μL染料加入離心管中，并在每個離心管中加入2 μL純化的PCR產(chǎn)物 (DNA)，旋渦震蕩混勻，10000 g離心2 min。

6.3用無菌去離子水將Qubit分子定量試劑盒中的100 ng/μL DNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為4個濃度，即50、25、10和5 ng/μL，再將已稀釋的2 μL DNA標(biāo)準(zhǔn)品分別加入4個不同的200 μL染料中。制作Qubit核酸測定儀的DNA標(biāo)曲，采用兩點定標(biāo)法，即加入1個空白 (不加DNA的染料) 和1個最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品；因為純化后的DNA濃度沒有檢測，所以選擇50 ng/μL濃度標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)曲，隨機(jī)檢測5?7份樣品，根據(jù)得到的結(jié)果調(diào)整高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的濃度再重新制作標(biāo)曲。

6.4提前在實驗記錄本上寫好每個庫的樣品編號，每測一份樣品，立刻記錄其濃度。統(tǒng)計每個庫中樣品的最高濃度和最低濃度之間的差異倍數(shù)，若大于5?10倍，則需將低濃度的樣品重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增與純化后再定量；若小于5?10倍，則可進(jìn)行后續(xù)實驗。

6.5混庫需滿足條件為：每份樣品的DNA總量=最低濃度樣品的DNA濃度×其樣品體積 (按14 μL計算)。即以濃度最低樣品的混庫體積14 μL為標(biāo)準(zhǔn)，計算其他樣品的混庫體積，具體計算方法為DNA總量÷樣品的DNA濃度。最后用移液器將30份樣品按上述計算得到的體積全部加入到一個無菌1.5 mL離心管中，并在管蓋和管壁上寫清楚樣品信息和定量日期。

致謝

感謝國家自然科學(xué)基金(91851104)、福建省自然科學(xué)基金(2019J02016)、廈門市科技計劃項目(3502Z20172024)的資助。

參考文獻(xiàn)

1.Amaral-Zettler, L. A., McCliment, E. A., Ducklow, H. W. and Huse, S. M. (2009). A method for studying protistan diversity using massively parallel sequencing of V9 hypervariable regions of small-subunit ribosomal RNA genes. PLoS One 4: e6372.

2.Xue, Y. Y., Chen, H. H., Yang J. R., Liu, M., Huang, B. Q. and Yang, J. (2018). Distinct patterns and processes of abundant and rare eukaryotic plankton communities following a reservoir cyanobacterial bloom. ISME J 12: 2263–2277.

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