在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里，如果你打開人類的抗癌武器庫(kù)，會(huì)發(fā)現(xiàn)手術(shù)和放化療占據(jù)了主力位置。但到了上個(gè)世紀(jì)，隨著人類與癌癥之間的斗爭(zhēng)愈發(fā)深入、戰(zhàn)況越發(fā)激烈，這些主力在戰(zhàn)場(chǎng)上的表現(xiàn)似乎有些“心有余而力不足”。

　　但上帝還為人類打開了一扇窗：科學(xué)家對(duì)于人體免疫系統(tǒng)的認(rèn)知逐漸成熟，一個(gè)能以一己之力對(duì)抗多種疾病的強(qiáng)大武器庫(kù)其實(shí)“遠(yuǎn)在天邊，近在眼前”。如何利用免疫武器庫(kù)，成為了上世紀(jì) 70 年代前后的一項(xiàng)重要研究議題。

免疫細(xì)胞（該圖片由 David Mark 在 Pixabay 上發(fā)布）

　　任職于英國(guó)劍橋大學(xué)的阿根廷科學(xué)家César Milstein[1]和德國(guó)科學(xué)家 Georges J.F. Köhler[2]，在 1975 年將正常的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到可以持續(xù)產(chǎn)生特異性抗體的雜交細(xì)胞，催生出雜交瘤技術(shù)[3]，是人類利用免疫系統(tǒng)的起點(diǎn)。

　　在 Milstein 和Köhler 因此獲得諾貝爾獎(jiǎng)[4]的同一年，治療淋巴瘤的理想目標(biāo)被鎖定。1997 年，靶向 CD20、治療復(fù)發(fā)或難治性惰性淋巴瘤的人鼠嵌合單抗 Rituximab 獲批上市，它也成為第一個(gè)獲批上市的抗癌單抗，開啟了全新的癌癥治療方式。

　　此后，隨著科學(xué)家對(duì)癌癥基因組學(xué)的研究，越來越多的靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，新的抗癌抗體不斷涌現(xiàn)。最激動(dòng)人心的轉(zhuǎn)折出現(xiàn)在2011 年，全球首個(gè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑 Ipilimumab 獲批應(yīng)用于臨床，開啟癌癥的免疫治療時(shí)代。

　　從雜交瘤技術(shù)誕生，到 2014 年紅遍全球的首個(gè)全人源 PD-1 單抗 Nivolumab 獲批，足足間隔了 40 年。

　　抗癌抗體技術(shù)從鼠源、人鼠嵌合、人源化，一步步走向全人源，歷經(jīng)數(shù)次激動(dòng)人心的革新與升級(jí)，才成就了今天的安全高效的腫瘤免疫治療。

　　接下來，就讓奇點(diǎn)糕為各位拆解那不凡的 40 年。

　　鼠源單抗：“一朝被蛇咬十年怕井繩”

　　事實(shí)上，抗體的存在直到 19 世紀(jì) 90 年代才被發(fā)現(xiàn)。它識(shí)別病毒、細(xì)菌、真菌，甚至寄生蟲的強(qiáng)大能力，讓科學(xué)家和醫(yī)生都“垂涎不已”。經(jīng)過漫長(zhǎng)的上下求索，1960 年代科學(xué)家才發(fā)現(xiàn)只有淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生抗體[2]。

B細(xì)胞釋放抗體

　　為了讓大家在視覺上對(duì)抗體有更直觀的感受，抗體示意圖一般被畫成字母“Y”的形狀。可以看到這個(gè)抗體由兩種顏色組成。其中的藍(lán)色部分，我們叫它恒定區(qū)，這個(gè)區(qū)域比較“保守”，很多不同抗體的這個(gè)區(qū)域是一模一樣的。

　　至于黃色部分，我們叫它可變區(qū)。這個(gè)區(qū)域是千變?nèi)f化的，可以說沒有兩種抗體的可變區(qū)是相同的，它決定了抗體的特異性。抗體識(shí)別病毒、細(xì)菌和癌細(xì)胞的能力，依賴的就是這個(gè)可變區(qū)。

抗體示意圖

　　今天我們已經(jīng)知道，人體的免疫系統(tǒng)有千億級(jí)別的“免疫衛(wèi)士”——淋巴細(xì)胞，它們占到體重的1% 左右，但能產(chǎn)生數(shù)以百萬計(jì)的特異性抗體，每一種抗體都能與對(duì)應(yīng)的抗原完美結(jié)合[5]，來對(duì)抗入侵者。

　　在Köhler 和 Milstein 發(fā)明生產(chǎn)單抗技術(shù)三年后，37 歲的日本分子生物學(xué)家利根川進(jìn)（Susumu Tonegawa）發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞生產(chǎn)抗體多樣性的機(jī)制，讓從千變?nèi)f化的抗體中找到“對(duì)的人”成為可能[6]。

　　但是新的問題來了：在生產(chǎn)單抗的過程中，制備雜交瘤用的是未經(jīng)改造的小鼠B細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。但如果把這種由小鼠產(chǎn)生的鼠源抗體直接用在人身上，人體免疫系統(tǒng)可能會(huì)把鼠源抗體當(dāng)做抗原清除掉[7，8]，不僅療效差，還會(huì)導(dǎo)致一些安全問題[9]。

　　盡管存在上述風(fēng)險(xiǎn)，但第一個(gè)單抗藥物 Muromonab-CD3（OKT3）還是在 1986 年被 FDA 批準(zhǔn)上市了。由于 OKT3 是全鼠源，存在強(qiáng)烈的免疫原性，50% 接受治療的患者產(chǎn)生了抗 OKT3 的抗體，治療效果大幅下降[9]。此外，OKT3 還會(huì)引起類似細(xì)胞因子風(fēng)暴的過敏反應(yīng)，這在很大的程度上限制了 OKT3 的臨床應(yīng)用。

　　在 OKT3 獲批之后的近 10 年時(shí)間里，F(xiàn)DA 都沒有再批準(zhǔn)其他的單抗藥物上市，單抗藥物的研發(fā)陷入低谷。

　　人鼠嵌合和人源化單抗：從“張冠李戴”到“易容術(shù)”

　　實(shí)際上，OKT3 的遭遇可以說是在科學(xué)家們意料之中。因?yàn)閹缀踉谕粫r(shí)間，很多科學(xué)家為了避免人體把鼠源抗體當(dāng)做外來的抗原清除掉，而絞盡腦汁。

　　最終，他們成功了。

　　看完此前的抗體介紹，你肯定已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了：能夠根據(jù)抗原“因地制宜”、高度定制化的可變區(qū)對(duì)于抗體的特異性非常重要。它就好比是抗體上的導(dǎo)航系統(tǒng)，決定了抗體要去進(jìn)攻誰。

　　科學(xué)家們隨之想到，只要把鼠源抗體的可變區(qū)嫁接到人源抗體的恒定區(qū)上，就可以在很大程度上降低抗體的免疫原性。這一設(shè)想的最終實(shí)現(xiàn)是在 1984 年，科學(xué)家們成功把鼠源抗體用來識(shí)別特定抗原的可變區(qū)“摘下”，“戴”在了人源抗體的恒定區(qū)上，人鼠嵌合抗體應(yīng)運(yùn)而生[10]。

　　不過面對(duì)人體“錙銖必較”的免疫系統(tǒng)，“戴著鼠源帽子”的人鼠嵌合抗體依然很扎眼，容易被當(dāng)作“不法分子”清除掉。因此隨著人們對(duì)抗體可變區(qū)認(rèn)識(shí)的加深，在識(shí)別特定抗原過程中起到關(guān)鍵作用的可變區(qū)碎片被發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家得以給鼠源抗體實(shí)施更加精細(xì)的“易容手術(shù)”。

各種類型抗體的結(jié)構(gòu)示意圖

　　1986 年，Jones 等人把鼠源單抗可變區(qū)的關(guān)鍵識(shí)別區(qū)域“摳”下來，然后僅僅把這些可變區(qū)碎片替換到人源抗體上，這就成了我們現(xiàn)在常說的人源化抗體。緊隨 Nivolumab 之后獲批的 Pembrolizumab 就是這種人源化抗體。

　　但是，無論是人鼠嵌合抗體，還是人源化抗體，它們都是科學(xué)設(shè)想與現(xiàn)實(shí)困難之間達(dá)成妥協(xié)的結(jié)果。無論它們攜帶的小鼠蛋白占比多低，哪怕只占整個(gè)抗體的 10% 以內(nèi)，都不能完全避免進(jìn)入人體后的免疫排斥或超敏風(fēng)險(xiǎn)。想通過這種“張冠李戴”的“換頭術(shù)”或“易容術(shù)”消滅鼠源部分帶來的免疫原性，可能性微乎其微。

　　唯一的機(jī)會(huì)就是全人源。

　　但全人源談何容易。在 Milstein 和Köhler 雜交瘤技術(shù)取得成功之際，就有很多科學(xué)家嘗試將人的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以生產(chǎn)全人源的單抗藥物。但幾乎所有的嘗試都是徒勞的，沒有人能將二者融合起來[11]。

　　全人源單抗：噬菌體展示與酵母展示的“帽子流水線”

　　新的曙光出現(xiàn)在 1970 年代，重組 DNA 技術(shù)的建立和發(fā)展，打破了不同生命之間的“種屬次元壁”。執(zhí)教于美國(guó)密蘇里大學(xué)的 George Smith 歷經(jīng)十余年的奮斗，以一己之力于 1985 年開發(fā)出了噬菌體展示技術(shù)[12]。

　　五年后，劍橋大學(xué) Gregory Winter 的團(tuán)隊(duì)利用噬菌體展示技術(shù)，成功獲得了正常折疊且功能完整的人源抗體片段[13]，就是我們前面介紹的黃色可變區(qū)。有了這個(gè)最重要的部分，只需再通過分子生物學(xué)手段把它嫁接到恒定區(qū)上[14]，一個(gè)完整的全人源抗體就誕生了。

噬菌體（該圖片由 Clker-Free-Vector-Images 在 Pixabay 上發(fā)布）

　　那么，噬菌體展示技術(shù)是如何生產(chǎn)并篩選抗體的可變區(qū)呢？首先，將人體內(nèi)制造抗體可變區(qū)的基因交給噬菌體，噬菌體就會(huì)指揮其宿主——大腸桿菌生產(chǎn)出各種抗體可變區(qū)，形成一個(gè)巨大的“抗體可變區(qū)庫(kù)”。然后再用目標(biāo)抗原，從這個(gè)庫(kù)里把能與特定抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)“釣”出來即可。

　　不過，噬菌體展示技術(shù)的缺點(diǎn)也是顯而易見的。它對(duì)抗體蛋白的修飾和折疊，與人體細(xì)胞差別非常大[15]。一定程度上影響了抗體可變區(qū)與抗原的親和力。

　　有研究表明，對(duì)癌癥的治療而言，治療效果是隨抗體的親和力增加而增加的[16]。而由噬菌體展示技術(shù)獲得的抗體可變區(qū)，其親和力通常不足以有效治療腫瘤[17]。因此，噬菌體展示技術(shù)獲得的抗體往往還需人工優(yōu)化[18]。

噬菌體篩選示意圖

　　為了解決噬菌體展示平臺(tái)面臨的問題， K. Dane Wittrup 等推出了基于真核生物酵母菌的酵母展示平臺(tái)[15,19]。去年年底在國(guó)內(nèi)獲批上市的 PD-1 單抗 Sintilimab 就是基于這個(gè)平臺(tái)開發(fā)的。

　　酵母展示平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了從原核表達(dá)系統(tǒng)到真核表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)步，不過酵母的蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)與人體依然有不小的差距 [20]，這對(duì)抗體功能也存在一定的影響。也正是這種差別在一定程度上限制了酵母展示平臺(tái)的應(yīng)用。

　　據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止 2017 年 5 月，全球共有 23 個(gè)全人源單抗藥被 FDA 批準(zhǔn)上市，其中通過噬菌體展示技術(shù)推出的抗體有 6 個(gè)，酵母展示平臺(tái)為0，剩余的 17 個(gè)全部來自后起之秀轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)[21]。

　　真正給全人源抗體領(lǐng)域帶來變革的，是轉(zhuǎn)基因小鼠的誕生。

　　全人源單抗：轉(zhuǎn)基因小鼠帶來的真·全人源

　　就在 Smith 推出噬菌體展示技術(shù)的同一年，如今身為美國(guó)科學(xué)院院士的 Frederick Alt，曾和他的幾位同事一起大膽預(yù)言：“日漸成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以讓小鼠表達(dá)人的抗體”[22]。

　　可以說，這一預(yù)言為未來數(shù)十年的研究指明了方向，越來越多的團(tuán)隊(duì)加入轉(zhuǎn)基因小鼠改造的行列[23，24]。研究的高潮在 1997 年被點(diǎn)燃，日本麒麟麥酒株式會(huì)社的石田功（Isao Ishida）領(lǐng)導(dǎo)的 10 人研究團(tuán)隊(duì)[25]，基本實(shí)現(xiàn)了將人的抗體生產(chǎn)系統(tǒng)搬到小鼠體內(nèi)。說來也巧，石田功正是我們前面介紹的 1987 年諾獎(jiǎng)得主，利根川進(jìn)的學(xué)生。

　　在隨后的幾年里，不同科研團(tuán)隊(duì)之間的通力合作，達(dá)到人體免疫系統(tǒng)水平的轉(zhuǎn)基因小鼠終于誕生了。

小鼠（該圖片由 Robert-Owen-Wahl 在 Pixabay 上發(fā)布）

　　與噬菌體展示和酵母展示平臺(tái)不同的是，轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)生產(chǎn)抗體的方式，是先破壞小鼠的免疫系統(tǒng)，然后將人體編碼抗體的 IgG 基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，并在小鼠體內(nèi)最大程度再現(xiàn)人體抗體生產(chǎn)系統(tǒng)，產(chǎn)生人源的 IgG 抗體。從這個(gè)層面上講，它已經(jīng)優(yōu)于前述的兩個(gè)平臺(tái)了。

　　另一方面，為了保持抗原可變區(qū)的多樣性，噬菌體展示和酵母展示依賴于人工引入突變，而轉(zhuǎn)基因小鼠則利用的是B細(xì)胞天然自主的體細(xì)胞超突變。理論上講，小鼠作為歷經(jīng)數(shù)百萬年的進(jìn)化的生命體產(chǎn)物，其引入突變的方式更優(yōu)于人工。

　　酵母展示平臺(tái)的發(fā)明人 Wittrup 等科學(xué)家，對(duì)已經(jīng)獲批上市和正在開展 2 期及以上級(jí)別臨床研究的所有單抗做了分析。他們發(fā)現(xiàn)與噬菌體展示相比，通過轉(zhuǎn)基因小鼠研發(fā)出來的抗體藥的成藥性更好[26]。

單抗發(fā)展歷程

　　至于如何利用轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)生產(chǎn)全人源單抗，我們就以之前介紹過的 Nivolumab 為例，為大家簡(jiǎn)單拆解一下。

　　首先利用 PD-1 免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠的B細(xì)胞受到人 PD-1 抗原的刺激之后，會(huì)啟動(dòng)體細(xì)胞超突變程序，增殖分裂成數(shù)以萬計(jì)、能產(chǎn)生不同人源抗體的B細(xì)胞。緊接著，就要用到Köhler 和 Milstein 發(fā)明的雜交瘤技術(shù)，從被 PD-1 免疫的小鼠體內(nèi)分離出B細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞融合。最后通過層層篩選，找到與 PD-1 親和性最高的人源抗體的雜交瘤。

　　回首通往全人源的“條條大道”，轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)雖較噬菌體展示技術(shù)晚出現(xiàn) 10 年，與酵母展示平臺(tái)幾乎同時(shí)登場(chǎng)，但因其在各方面表現(xiàn)出來的種種優(yōu)勢(shì)，使其生產(chǎn)的全人源單抗獲批上市數(shù)量最多。

轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體示意圖

　　正如著名免疫學(xué)家 Sefik S. Alkan 所說，單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)改變了生物醫(yī)學(xué)的面貌，并可能在未來幾個(gè)世紀(jì)深入影響我們的生活[2]。

　　1975 年到 2014 年，這 40 年間無數(shù)科學(xué)家前赴后繼的努力，不僅改寫了人類抗癌的歷史，也毫無疑問將改變未來數(shù)百年人們的健康。

　　謹(jǐn)以此文致敬這始于一個(gè)瘋狂創(chuàng)想的 40 年，這布滿了不厭其煩瘋狂嘗試的 40 年，這在瘋狂背后暗含勇氣和對(duì)科學(xué)的堅(jiān)持的 40 年。

　　編輯神叨叨：奇點(diǎn)糕教你慧眼識(shí)單抗

　　最后教大家一個(gè)快速識(shí)別單抗類型的方法。

　　單抗名字最末尾的 mab 代表的是單抗，mab 前面的1-2 個(gè)字母里面藏著單抗命名的法則：如果是o，那它就是鼠源抗體；如果是xi，那它就是人鼠嵌合抗體；如果是zu，說明是人源化抗體；如果只有一個(gè)u，那就是全人源抗體。

　　參考資料：

　　[1].Milstein C. From the structure of antibodies to the diversification of the immune response.[J]. The EMBO Journal, 1985, 4(5): 1083-1092. DOI：10.1002/j.1460-2075.1985.tb03744.x

　　[2].Alkan S S. Monoclonal antibodies: the story of a discovery that revolutionized science and medicine[J]. Nature Reviews Immunology， 2004, 4(2): 153-156. DOI：10.1038/nri1265

　　[3].Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature, 1975, 256(5517): 495-497. DOI：10.1038/256495a0

　　[4].https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1984/summary/

　　[5].Jerne N K. THE NATURAL-SELECTION THEORY OF ANTIBODY FORMATION.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1955, 41(11): 849-857. DOI：10.1073/pnas.41.11.849

　　[6].https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1987/press-release/

　　[7]. Ortho Multicenter Transplant Study Group. A randomized clinical trial of OKT3 monoclonal antibody for acute rejection of cadaveric renal transplants[J]. New England Journal of Medicine, 1985, 313(6): 337-342 DOI：10.1056/NEJM198508083130601

　　[8]. Kuus-Reichel K, Grauer L S, Karavodin L M, et al. Will immunogenicity limit the use, efficacy， and future development of therapeutic monoclonal antibodies?[J]. Clinical and diagnostic laboratory immunology， 1994, 1(4): 365-372.

　　[9]. Baert F, Noman M, Vermeire S, et al. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease[J]. New England Journal of Medicine, 2003, 348(7): 601-608. DOI：10.1056/NEJMoa020888

　　[10]. Alt F W, Blackwell T K, Yancopoulos G D, et al. Immunoglobulin genes in transgenic mice[J]. Trends in Genetics, 1985: 231-236. DOI：10.1016/0168-9525(85)90089-7

　　[11].Alkan S S, Mestel F, Jiricka J, et al. Estimation of heterokaryon formation and hybridoma growth in murine and human cell fusions[J]. Hybridoma, 1987, 6(4): 371-379. DOI：10.1089/hyb.1987.6.371

　　[12].Smith G P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228(4705): 1315-1317. DOI：10.1126/science.4001944

　　[13].Mccafferty J, Griffiths A D, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains[J]. Nature, 1990, 348(6301): 552-554. DOI：10.1038/348552a0

　　[14].https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2018/press-release/

　　[15].Boder E T, Wittrup K D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries[J]. Nature Biotechnology， 1997, 15(6): 553-557. DOI：10.1038/nbt0697-553

　　[16].Schlom J, Eggensperger D, Colcher D, et al. Therapeutic Advantage of High-Affinity Anticarcinoma Radioimmunoconjugates[J]. Cancer Research, 1992, 52(5): 1067-1072.

　　[17].Schier R, Bye J M, Apell G, et al. Isolation of High-affinity Monomeric Human Anti-c-erbB-2 Single chain Fv Using Affinity-driven Selection[J]. Journal of Molecular Biology， 1996, 255(1): 28-43. DOI：10.1006/jmbi.1996.0004

　　[18].Cherf G M, Cochran J R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering[J]. Methods of Molecular Biology， 2015: 155-175. DOI：10.1007/978-1-4939-2748-7_8

　　[19].https://www.adimab.com/platform-overview

　　[20].Ho M, Nagata S, Pastan I, et al. Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(25): 9637-9642. DOI：10.1073/pnas.0603653103

　　[21].https://lifescivc.com/2017/05/human-antibody-discovery-mice-phage/

　　[22].Alt F W, Blackwell T K, Yancopoulos G D, et al. Immunoglobulin genes in transgenic mice[J]. Trends in Genetics, 1985: 231-236. DOI：10.1016/0168-9525(85)90089-7

　　[23]. Lonberg N, Taylor L D, Harding F A, et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.[J]. Nature, 1994, 368(6474): 856-859. DOI：10.1038/368856a0

　　[24]. Green L, Hardy M C, Maynardcurrie C E, et al. Antigen–specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs[J]. Nature Genetics, 1994, 7(1): 13-21. DOI：10.1038/ng0594-13

　　[25].Tomizuka K, Yoshida H, Uejima H, et al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice.[J]. Nature Genetics, 1997, 16(2): 133-143. DOI：10.1038/ng0697-133

　　[26].Jain T, Sun T, Durand S, et al. Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(5): 944-949. DOI：10.1073/pnas.1616408114

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的致敬肿瘤免疫40年！免疫细胞与癌细胞融合，让小鼠表达人的抗体的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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